茯砖茶中茶褐素的抗氧化性研究

Antioxdant Activity of Theabrownine from Fuzhuan Brick Tea

摘要: 本研究对茯砖茶中的茶褐素提取纯化，考察茶褐素对羟基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)的抗氧化性能。试验结果表明，茶褐素对羟自由基清除率为50.2%，并且不同纯度的茶褐素消除效果稍有差别。而对DPPH清除率高达90%，在低浓度下茶褐素的抗氧化性大于维生素C (Vc)。

Abstract: In this study, theabrown was extracted and purified from Fuzhuan brick tea. The antioxidant ac-tivities of theabrown on hydroxyl free radical and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) were studied. The antioxidant activity test result showed that the theabrown on hydroxyl free radical with a scavenging capacity of 50.2%, and the elimination of theabrown with different purity against hydroxyl radicals is different. While scavenging capacity of theabrown on DPPH free radical was up to 90%, and the antioxidant activity of theabrown at low concentration was higher than that of Vc.

1. 引言

茶褐素是茶多酚、茶黄素和茶红素继续氧化和聚合的最终产物，是一类分子差异极大的复杂高聚合物 [1] [2] ，已有的研究表明茶褐素具有消食去腻、减肥防龋、降血脂、降低胆固醇等多种保健功能和显著的抗疲劳、降血脂的药理疗效 [3] [4] 。目前对于茶褐素的研究多集中在绿茶 [5] 、普洱茶和红茶方面 [6] - [11] ，而茯砖茶茶褐素抗氧化研究鲜见文献报道。何英姿 [12] 发现六堡茶茶褐素对羟基自由基的清除率高达74％，同条件低浓度情况下比Vc的高，对亚硝基的清除作用与Vc基本相当，最高可达73%，对超氧阴离子自由基的清除率最高为60%。周向军 [13] 研究发现乌龙茶茶褐素对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH具有一定的清除效果，虽清除效果均低于Vc，但在同类天然提取物中，茶褐素提取物仍具有明显优势，具有较大的开发价值。茯砖茶中的茶褐素(TB)含量很高，约占茶干量17.3% [14] 。本研究对茯砖茶中的茶褐素进行提取纯化，对其抗氧化活性进行研究，以期为茯砖茶茶褐素的开发利用提供理论参考。

2. 实验部分

2.1. 实验材料

茯砖茶(2018年产，湖南城院生物科技)；正丁醇(天津富宇精细化工)、三氯甲烷(天津富宇精细化工)、乙酸乙酯(天津恒兴化学试剂)、无水乙醇(天津富宇精细化工)、双氧水(30%，广州华杭化工材料)、硫酸亚铁(天津大茂化学试剂)、水杨酸(济南英东化工)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH, 北京中生瑞泰科技)，均为分析纯；维生素C (Vc，≥ 99.7%，天津致远化学试剂)。

2.2. 溶液的配制

1) DPPH-乙醇溶液的配制：称取DPPH质量为2.0 mg，用25 mL无水乙醇溶解配成0.08 g·L⁻¹的DPPH-乙醇溶液，放冰箱冷藏。

2) 水杨酸-乙醇溶液的配制：称取水杨酸34.53 mg，溶于50 mL容量瓶中，制成5 mmol·L⁻¹的水杨酸-乙醇溶液。

3) 硫酸亚铁溶液的配制：称取水杨酸38 mg，溶于50 mL容量瓶中，制成5 mmol·L⁻¹的硫酸亚铁溶液。

4) 双氧水配制：取27.77 mg 30%的双氧水稀释成4.9 mmol·L⁻¹，现配现用。

4) Vc溶液配制：取1 mg溶于25 mL容量瓶中制成浓度为0.4 g·L⁻¹，然后稀释成实验所需的浓度。

5) 样品溶液的配制：取茶褐素样品0.1 g分别溶于25 mL容量瓶中得4.0 g·L⁻¹，然后将其稀释成实验所需浓度。

2.3. 茯砖茶中茶褐素提取纯化

按照文献 [2] ，将茯砖茶粉碎干燥到恒重后索氏提取，提取液用等体积的正丁醇萃取三次，得到水相，除去皂甙。水相再用等体积的三氯甲烷萃取三次，除去咖啡碱。将水相用等体积的乙酸乙酯萃取三次，得到水相，除去茶黄素和茶红素，加过量的无水乙醇使茶褐素沉淀，过滤干燥得到茶褐素，其提取纯化流程见图1。本研究中，茶褐素提取率为16.1%。

Figure 1. Flow chart of extraction and purification of theabrownine from fuzhuan tea

图1. 茯砖茶中茶褐素的提取纯化流程图

2.4. 茶褐素对羟基自由基的清除实验

茶褐素对羟基自由基的清除作用依据文献 [15] [16] 稍作修改。把三种样品配制浓度为4.0、2.0、1.0、0.50、0.25 g·L⁻¹的样液，分别把不同样液在96孔板中滴入50 μL，5 mmol·L⁻¹水杨酸-乙醇50 μL，5 mmol·L⁻¹ FeSO₄ 50 μL，最后加入4.9 mmol·L⁻¹ H₂O₂ 50 μL启动反应，在恒温箱中37℃反应30 min。以蒸馏水和无水酒精体积比3:1混合液为空白对照，在510 nm下测量各待测液的吸光度。考虑到样品本身的吸光值，以5 mmol·L⁻¹水杨酸-乙醇50 μL，5 mmol·L⁻¹ FeSO₄ 50 μL，不同浓度的样液50 μL，用双蒸水代替H₂O₂，为茶褐素的背景吸收。考虑到其他液体的吸光值，以5 mmol·L⁻¹水杨酸-乙醇50 μL，5 mmol·L⁻¹ FeSO₄ 50 μL，不同浓度的样液用蒸馏水代替50 μL，最后加入4.9 mmol·L⁻¹ H₂O₂ 50 μL启动反应，为阴性对照吸收。计算清除率并进一步计算其IC₅₀值。清除率(S)按照公式(*)进行计算。

$S=\left(1-\frac{A_0-A_x}{A}\right)\times 100\%$ (*)

A₀为样品液的吸光度；A_x为样品液背景的吸光度；A为不加茶褐素溶液的阴性对照吸光度。

2.5. 茶褐素对DPPH自由基的清除实验

依据文献 [12] [13] [17] 的方法，把样品配制浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 g·L⁻¹的样液100 μL，分别加0.08 g·L⁻¹的DPPH-乙醇溶液100 μL，作为样品测试组A。蒸馏水与无水乙醇体积比1:1混合共200 μL作为参比液，100 μL蒸馏水加100 μL DPPH-乙醇溶液作为样品阴性组A；各浓度样品液100 μL加100 μL蒸馏水作为样品背景组A_x，将不同浓度样液按上述配比移入96孔板中，然后在恒温箱中37℃反应30 min。计算清除率并进一步计算其IC₅₀值。清除率的计算依据公式(*)。

3. 结果与讨论

3.1. 茶褐素对羟基自由基清除作用

羟基自由基是新陈代谢过程中产生的作用最强、毒性最大的一种活性氧自由基，它能氧化损伤和破坏生物体内的核酸、蛋白质、脂类等大分子物质，导致疾病。因此，研究茯砖茶中茶褐素提取液对羟基自由基的清除能力具有重要意义。本研究采用水杨酸-Fe²⁺氧化法，其机理是利用茶褐素中的酚羟基与金属离子螯合，阻止OH生成。

茶褐素对羟基自由基的清除效果并以Vc作对比分别见图2和图3。从图可知，茶褐素对羟自由基的清除率随其质量浓度的增大而逐渐增高，且在2.0~5.0 g·L⁻¹内其清除效果随其浓度的增加几乎成线性增长，但浓度达到4.0 g·L⁻¹其对羟基自由基的清除率才超过50%，说明茶褐素对羟基自由基的清除作用不强。茶褐素是由茶多酚类物质进一步氧化而来，把酚羟基结构氧化成醛或羧基，导致茶褐素中含有的酚羟基结构少，从而与金属离子的螯合能力减弱，可能这是茶褐素对OH的抗氧化性不强的原因。经IC₅₀软件计算知，Vc的IC₅₀为0.0118 g·L⁻¹，可知茶褐素对羟基自由基清除率不高，虽然仍然低于Vc，但茶褐素在天然提取物中仍然具有优势。

Figure 2. Scavenging rate of hydroxyl free radical by theabrownine with different concentration

图2. 茶褐素对羟基自由基清除作用影响

Figure 3. Scavenging rate of hydroxyl free radical by Vc with different concentration

图3. 不同浓度Vc对羟基自由基清除作用影响

3.2. 茶褐素对DPPH自由基清除作用

以Vc作对照测定茶褐素对DPPH自由基的清除率，见图4和图5。可知，在一定范围内茶褐素对DPPH自由基的清除率随其质量浓度的增大而逐渐增高，且在0.01~0.1 g·L⁻¹内其清除效果随其浓度的增加呈急剧的线性增长，最高清除率可达到90%。经IC₅₀软件计算知，Vc和不同纯度茶褐素的IC₅₀分别为0.07 g·L⁻¹、0.022 g·L⁻¹，可知茶褐素具有很高的DPPH自由基清除率，茶褐素在天然提取物中具有很大的优势。

Figure 4. Scavenging rate of DPPH free radicals by theabrownine with different concentration

图4. 不同浓度茶褐素对DPPH自由基清除

Figure 5. Scavenging rate of DPPH free radicals by Vc with different concentration

图5. 不同浓度Vc对DPPH自由基清除作用影响

4. 结论

在对茯砖茶中茶褐素进行了提取纯化的基础上，对茶褐素的抗氧化性进行了对比性研究。茶褐素浓度为4.0 g/L时对羟基自由基的清除率达50.2%，具有一定的抗氧化性，但在低浓度下较Vc对羟基自由基的清除效果差。在低浓度下对DPPH自由基的清除率达到90%，但在低浓度下较Vc对DPPH自由基的清除效果强。茶褐素具有良好的抗氧化活性，在抗氧化应用方面有良好的前景，可为茯砖茶的深度开发提供数据支持。

基金项目

黑茶金花湖南省重点实验室(2016TP1022)、湖南省自然科学基金(2017JJ2018)。