1. 引言
特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种严重威胁人类健康的疾病，该疾病具有进行性发展特点。特发性肺纤维化组织主要由胶原纤维构成。目前基础临床研究中常常需要区分特发性肺纤维的程度，尤其是对早期肺纤维化的识别，这对肺纤维化的组织学评价尤为重要。因此，选择一种合适的胶原纤维的染色方法对于特发性肺纤维化研究是非常重要的。
Masson染色(Masson stainings)，即马松染色。组织经Masson染色，肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，该染色临床主要用于区分胶原纤维和肌纤维。因此，结缔组织经Masson染色后易于辨识胶原纤维。本研究拟通过Masson染色与HE染色观察肺纤维化的进展，以探讨Masson染色在肺纤维化观察研究中的意义。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 实验试剂
博来霉素粉剂BLM (瀚晖制药有限公司，批号：H20055883)；生理盐水(国药准字，批号：H33020615)；苏木素染色试剂(北京索莱宝科技有限公司，批号：718118)，伊红染色试剂(北京索莱宝科技有限公司，批号：718123)，Masson染色试剂盒(北京中杉金桥，批号：C211201)，硫酸庆大霉素(华中药业股份有限公司，批号：H42021503)。
2.1.2. 实验动物
16周龄，SPF级雄性SD大鼠18只，三峡大学动物中心提供。
2.2. 方法
2.2.1. 实验动物造模
SD大鼠适应性饲养一周，10%的水合氯醛按0.35 ml/100 g剂量腹腔注射麻醉。SD大鼠气管切开，按4 mg/kg的剂量抽取BLM药剂气管内注射灌注给药。注射完毕，庆大霉素消毒手术创口并缝合，SD大鼠苏醒后正常饲养。SD大鼠给药后常规观察：活动、饮食、体重及肺部有无哕音。
2.2.2. 实验动物取材分组
SD大鼠造模后开始计算天数，按照处死时间进行分组：1~7 d，7~14 d，7 d~28 d分别为Q1，Q2，Q3，每组6只。
2.2.3. 固定包埋切片
10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射。待麻醉成功，开胸，取出肺脏，置10%福尔马林中固定24小时。
肺组织常规梯度酒精脱水，二甲苯透明至组织块半透明状，液体石蜡浸蜡、包埋并连续切片。
2.2.4. HE染色
SD大鼠肺组织切片常规脱蜡至水化；苏木素–伊红染色；脱水、透明、封片。显微镜下观察SD大鼠肺组织肺纤维化动态变化。
2.2.5. Masson染色
SD大鼠肺组织白片常规脱蜡至水化；Weigert铁苏木素染色，1%盐酸酒精分化；丽春红酸性品红染色，1%磷钼酸水溶液分化；苯胺蓝染液复染，1%冰醋酸水溶液分化；脱水、透明、封片。显微镜观察SD大鼠肺组织肺纤维化动态变化。
3. 结果
SD大鼠肺组织染色纤维化观察Q1组，肺间隔血管扩张充血，肺泡内浆液性及纤维素渗出，间隔内巨噬细胞增生及成纤维细胞浸润；Q2组成纤维细胞增多、胶原聚集在肺泡及肺泡间隔中；Q3组肺组织实变、胶原化。
HE染色切片，增生纤维结缔组织及肌组织，包括胶原化纤维组织，均呈红色，胶原化组织没有层次、观察不清晰(图1(a)，图2(a))；Masson染色呈清晰蓝色，成熟胶原组织呈深蓝色，幼稚胶原组织呈浅蓝色，结构清晰，与周围红染肺泡上皮细胞胞质、网状纤维、弹力纤维及平滑肌组织易于区分(图1(b)，图2(b))。
Figure 1. Q2 pulmonary tissue specimen (a) HE stainings; (b) Masson stainings
图1. Q2肺组织标本 (a) HE染色法；(b) Masson染色法
Figure 2. Q3 pulmonary tissue specimen (a) HE stainings; (b) Masson stainings
图2. Q3肺组织标本 (a) HE染色法；(b) Masson染色法
4. 讨论
特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种慢性、纤维化性间质性肺炎，形态与常见间质性肺炎的组织学和放射学特征相关，其原因不明。IPF主要发病人群为老年人，具有呼吸困难等肺功能进行性恶化特征。其症状包括肺功能不可逆下降，进行性肺瘢痕形成及间质性肺炎等。该疾病病因不明，IPF与多种遗传和环境风险因素有关。疾病进展常见，且预后不良[1] [2]。目前尚未有特效药可以逆转肺纤维形态学改变，因此肺纤维化形态学及其机制研究成为临床基础研究的热点。
临床基础研究中，目前，常用博来霉素气管注射构建特发性肺纤维化模型作为研究材料。博来霉素对肺组织损伤性炎症是肺纤维化的启动因素。肺纤维化启动后呈现急性炎症期、急性炎症–纤维化交界期、纤维化稳定期三个时期[3]，不同时期胶原化程度是不一致的。由于HE染色对于胶原纤维、肌纤维的辨识度不高，不具有特异性，因此，采用特异胶原纤维染色方法对研究非常重要。
苏木素–伊红染色法(HE stainings)，是一种常用的病理组织切片染色方法。该方法使用苏木素和伊红两种染料，苏木素为碱性染料，细胞核与之结合着蓝色，伊红为酸性染料，细胞质与之结合着红色。HE染色法是临床病理学中最基本、最广泛的技术方法。
狭义上讲，结缔组织包含以下三种结构：胶原纤维、网状纤维、弹力纤维，这三种纤维HE染色均为红色。胶原纤维组织在HE染色中缺乏特异性，在显微镜下不容易被分辨出来。
特发性肺纤维化主要为增生胶原纤维，HE染色时，胶原纤维、网状纤维及弹力纤维呈紫红色及肌纤维均呈嗜伊红染色，难以辨别早、晚期纤维化程度。因此不能单纯依靠HE染色准确判断肺纤维化程度。
胶原纤维是三种纤维中分布最广泛，含量最多的一种纤维。胶原纤维是主要含有胶原蛋白，脯氨酸和羟脯氨酸等的组合物。其含有碱性氨基酸，能够与酸性染料进行结合反应，胶原纤维染色就是利用两种阴离子(酸性)染料混合一起或先后作用而完成鉴别染色。
Masson染色是由Mallory氏苯胺蓝菊黄G发展改良而来[4]，是传统经典的胶原纤维染色法，常用于胶原纤维和肌纤维的鉴别染色。Masson染色是指用2~3种阴离子染料混合染色，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，是用来区分间叶组织来源的染色方法之一[5]。其基本原理是利用不同组织对染料分子的渗透性不同及染料分子本身的大小来实现，小分子能进入结构比较致密，渗透性比较低的组织。染料中苯胺蓝分子量大，易于穿透结构疏松、渗透性高的胶原纤维组织，呈蓝色。染料中丽春红分子量小，易于穿透结构致密、渗透性低的肌纤维，呈红色。因此，该方法能很好地使肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色[6]。Masson染色方法，是胶原纤维和肌纤维的染色方法，能够对正常组织和病理组织进行胶原结构的观察。
本实验研究结果显示：肺泡间隔中胶原纤维呈蓝色，其他纤维呈红色。而且，随着实验时间延长，SD大鼠肺纤维化组织老化、胶原化程度不同，染色深浅也不同。早期胶原化组织苯胺蓝染色呈浅蓝色，晚期呈亮蓝色。同HE染色相比，Masson染色不仅能够将肺纤维化的胶原化组织从纤维组织及肌组织中分辨出来，而且能够更清楚地显示肺纤维化中新鲜胶原及陈旧胶原。层次鲜明的颜色对比更有助于区分肺间隔纤维化的程度和新旧判定，提高早期肺纤维化检出率。
综上所述，Masson染色能提高早期肺纤维化检出率，并易于区分肺纤维化的程度和新旧。Masson染色是一项便捷、快速、经济的胶原纤维染色方法，该检测方法有助于更加准确地对SD大鼠肺纤维化程度进行客观评价，为肺纤维化研究提供检测手段，具有重要临床基础研究应用价值。
项目基金
湖北省中医药管理局项目“福白菊挥发油对结肠癌细胞生长抑制作用及其分子机制的研究”(No.ZY2023F139)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。