IMiDs作为PPI稳定剂在蛋白质降解方面的研究进展

Research Progress of IMiDs as PPI Stabilizer in Protein Degradation

摘要: 在过去的二十年里，随着IMiD和indisulam等MG降解剂的出现，分子胶(MGs)逐渐引起了制药界的关注。这些分子通过促进靶蛋白和E3连接酶之间的相互作用来降解靶蛋白。此外，MGs作为化学诱导剂，促进同源蛋白和异源蛋白的二聚化形成三元复合物，在调节生物活性方面具有很大的前景。本文重点介绍MGs在药物开发领域的应用，包括蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)稳定性和蛋白质降解。我们深入分析了各种MGs的结构以及MGs与各种生物活性分子之间的相互作用，从而为PPI稳定剂和新型降解剂的开发提供了新的视角。

Abstract: Over the past two decades, molecular glues (MGs) have gradually attracted the attention of the pharmaceutical community with the advent of MG degraders such as IMiDs and indisulam. Such molecules degrade the target protein by promoting the interaction between the target protein and E3 ligase. In addition, as a chemical inducer, MGs promote the dimerization of homologous proteins and heterologous proteins to form ternary complexes, which have great prospects in regulating biological activities. This review focuses on the application of MGs in the field of drug development including protein-protein interaction (PPI) stability and protein degradation. We thoroughly analyze the structure of various MGs and the interactions between MGs and various biologically active molecules, thus providing new perspectives for the development of PPI stabilizers and new degraders.

1. 引言

生物分子的分级组装在生命系统中起到至关重要的作用，用于维持细胞结构、细胞迁移、运输、DNA修饰和转录、染色质调节、蛋白质折叠、定位和降解等过程。作为化学诱导剂，分子胶促进同源蛋白、异源蛋白、DNA、RNA之间的二聚化或共定位从而形成三元复合物，在调节生命活动方面拥有巨大前景。本综述聚焦于免疫调节剂作为PPI稳定剂在蛋白降解方面的应用，用以发掘IMiDs在医药领域的其他应用。

Figure 1. History of thalidomide development

图1. 沙利度胺发展史

免疫调节剂主要包括沙利度胺、来那度胺和泊玛度胺。沙利度胺于1954年首先在联邦德国合成，1956年在德国上市，被广泛用于镇静剂及预防妊娠性孕吐。1960年欧洲的医生发现，本地区畸形婴儿的出生率明显上升，罪魁祸首便是“反应停”沙利度胺[1]。因此，1961年，沙利度胺在全世界范围内被召回并禁用，1963年正式退市。“反应停”事件使得沙利度胺在医药界“臭名昭著”，导致了新药试验法规的诞生，同时也使医药学家开始认识到药物的手性在用药安全中的重要性。“反应停”事件后，医药学家对沙利度胺的研究并未停止。1965年，以色列医生Jacob Sheski意外发现沙利度胺可以有效减轻麻风病皮肤结节红斑患者的皮肤症状。随后的研究证明它可以通过靶向肿瘤抑制因子TNF-α降低人体的免疫过度反应。并且沙利度胺及其衍生物还可以调节几种细胞因子的产生，如白细胞介素-2和干扰素γ，以调节自然杀伤(NK)细胞和T细胞的功能[2]-[4]。此外，沙利度胺通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)来阻断新血管的形成[5]。2006年，FDA批准沙利度胺与地塞米松联合用于治疗多发性骨髓瘤。此外，沙利度胺类似物来那度胺和泊马度胺分别于2006年和2013年获得FDA批准[6]-[8] (图1)。

近二十年来，经过药理学家对沙利度胺作用机制的不断研究，逐渐揭开了这个“天使魔鬼”药物的神秘面纱。

2. IMiDs调节免疫反应和抗血管形成的作用机制

2.1. 沙利度胺调节免疫反应的作用机制

Figure 2. Metabolism of thalidomide by cytochrome P450 enzymes

图2. 细胞色素P450酶对沙利度胺的代谢

Figure 3. Mechanism of thalidomide in regulating immune response and anti-angiogenesis

图3. 沙利度胺调节免疫反应和抗血管形成的作用机制

如图2，图3所示，沙利度胺的多重药效很大程度上来自于其代谢产物。人体内的药物代谢酶CYP2C19 将沙利度胺氧化为活性代谢物，该物质的其中一个靶点是肿瘤坏死因子TNF-α。TNF-α是核转录因子NF-kB多种诱导物中的一种。NF-kB信号通路是介导人体内炎症反应最重要的通路。在一般情况下，NF-kB通常与IkB结合维持在抑制状态。TNF-α与细胞表面或细胞内受体结合后，活化IKK复合物，进而导致NF-kB/IkB复合物上IkB的磷酸化，之后IkB上的Lys48泛素化经由蛋白酶体途径降解。IkB被降解后，NF-kB进入细胞核调控相关基因的转录。沙利度胺氧化后的活性代谢物通过干扰TNF-α诱导的IKK激活防止IkB与NF-kB分离，阻止其核易位和诱导在细胞增殖、炎症、血管生成和防止细胞凋亡中起作用的基因。

2.2. 沙利度胺抗血管形成的作用机制

沙利度胺抗血管形成的作用来自于其活性代谢物对激活血管内皮生长因子(VEGF)两条信号通路的抑制(图3)。VEGF是人体生理的一种糖蛋白，它能够促进新生血管的形成，增加血管的通透性，促进血管内皮细胞的迁移、增殖和分裂。由于肿瘤细胞增殖快，VEGF过表达和过度活化就成了肿瘤生长、侵袭和转移的必要条件。缺氧诱导因子(HIF-1)最重要的靶点之一VEGF。正常细胞中HIF-1表达量相当少。但由于肿瘤细胞增殖速度快，一直处于缺氧的微环境中，HIF-1便会高表达。首先NF-kB的功能被抑制使得缺氧诱导因子1 (HIF-1)积累减少，最终导致VEGF一直处于拮抗状态。其二，有研究表明前列腺素合成限速酶环氧合酶-2 (COX-2)在肿瘤发展中有重要作用，其中一个作用就是介导前列腺素(PE2)的反式激活及核易位，诱导VEGF基因的转录和表达。沙利度胺的活性代谢物通过阻断COX-2对PE2的激活来下调VEGF的表达水平。

2.3. IMiDs致畸性的作用机制

Figure 4. Thalidomide induces ubiquitination and degradation of SALL4, which ultimately leads to embryonic developmental malformations

图4. 沙利度胺诱导SALL4的泛素化和降解最终导致胚胎发育畸形

2010年，一项具有里程碑意义的研究表明，沙利度胺的主要靶点是CRBN，一种cullin-RING连接酶4 (CRL4)的底物受体[9]。包含一个N端Lon蛋白酶样结构域、一个中间螺旋束(HB)和一个涉及药物结合口袋的C端沙利度胺结合结构域(TBD)。CRL4是一种E3泛素连接酶复合物，由Cul4、DDB1和RBX1组成，通过靶向细胞底物进行泛素化，参与调节细胞周期、DNA损伤修复和染色质复制[10] [11]。两种蛋白CRBN和DDB1被沙利度胺洗脱。但当细胞内CRBN被耗尽时，未检测到被洗脱下来的DDB1。这个结果初步证明沙利度胺通过结合CRBN发挥作用，并且也揭示了DDB1被洗脱是与CRBN形成多元复合物的结果。进一步的斑马鱼胚胎内研究证实了CRBN被抑制会导致斑马鱼胸鳍发育缺失。这种现象不禁让人联想到沙利度胺导致的胚胎发育畸形现象。因此，他们认为沙利度胺抑制了CRBN的活性导致某种蛋白的积累，最终造成胎儿畸形。根据这个假设，CRBN敲除也应该导致这种未知底物的积累和随后的出生畸形，但由于物种遗传的差异，胚胎畸形现象在CRBN敲除的小鼠中没有观察到。虽然这个假设不能完全解释沙利度胺是如何导致出生缺陷的，但它首次将沙利度胺的活性与CRBN和含有CRBN的E3连接酶联系起来。

事实上，沙利度胺的致畸性来自于沙利度胺/CRBN复合物诱导的SALL4蛋白的降解[12] [13]。Spalt样转录因子4 (SALL4)是一种C2H2型锌指转录因子，对胚胎发育至关重要。SALL4可以与表观遗传机制相互作用以调节基因表达SALL4与Gli3合作调节前近端骨骼元件和依赖Shh的后骨骼元件的发育。SALL4 基因的功能丧失突变可导致Duane放射线综合征(DRRS)和Holt-Oram综合征(HOS)。DRRS或HOS患者与暴露于沙利度胺的婴儿具有非常相似的表型，例如肢体异常、心脏和耳朵损伤。其中一些患者被误诊为沙利度胺胚胎病，后来发现携带可遗传的SALL4突变。沙利度胺/CRBN复合物的作用底物之一就是SALL4。SALL4的泛素化和降解最终导致胚胎发育畸形(图4)。

2.4. IMiDs作为分子胶降解剂降解含锌指结构的转录因子

虽然直到2019年，IMiDs才第一次被提出其作为蛋白–蛋白分子胶降解某些底物蛋白，但实际上，从2010年沙利度胺被鉴定可以结合CRBN之后，就有许多IMiDs/CRBN复合物的底物蛋白被报道，这些蛋白均由IMiDs/CRBN介导泛素化最后经泛素–蛋白酶体途径降解。无一列外，IMiDs在这些途径中都充当了CRBN和底物蛋白之间“分子胶”的作用。

2014年，两项研究报告称，来那度胺与CRL4CRBN E3连接酶结合，泛素化并降解两种骨髓瘤发展必需的淋巴转录因子IKZF1和IKZF3，导致骨髓瘤细胞凋亡[14] [15]。这也解释了为什么IMiDs能够抑制骨髓瘤的发展，除了抑制血管内皮生长因子的活性外，淋巴转录因子的下调也是一个重要原因。另一项研究表明，来那度胺募集CRL4CRBN E3连接酶泛素化并降解酪蛋白激酶1 (CK1α)，导致del (5q) MDS细胞死亡[16]。2017年，ZFP91被鉴定为IMiDs-CRL4CRBN复合物的新底物[17]。

结构研究表明，这些IMiDs/CRBN的底物大部分都是含锌指结构的转录因子，都含有特征性的β-发夹基序，在关键位置有一个甘氨酸。目前，IMiDs/CRL4CRBN/转录因子复合物的几种晶体结构已被解析，以阐明沙利度胺分子胶募集和降解靶蛋白的机制和底物特异性。DDB1-CRBN-IMiDs的晶体结构复合物表明沙利度胺及其类似物的结合位点是CRBN表面上的一个浅疏水口袋，由三个关键色氨酸残基人CRBN中的Trp380、Trp386和Trp400组成。IMiD中常见的戊二酰亚胺环被容纳在小的疏水性三色氨酸口袋并形成疏水性和氢键相互作用。IMiD的邻苯二甲酰亚胺部分暴露在CRBN表面，有助于招募新蛋白质进行降解。

CRBN/来那度胺/CK1α复合物的晶体结构说明了来那度胺如何作为分子胶促进CRBN和CK1α之间的相互作用。通常，CRBN和来那度胺一起形成与CK1α的β-发夹环相互作用的结合界面。来那度胺的戊二酰亚胺部分结合在CRBN疏水口袋中，而邻苯二甲酰亚胺环暴露在表面并与CK1α形成范德华相互作用。当与CK1α结合时，观察到CRBN中来那度胺的构象变化，其邻苯二甲酰亚胺基团转移到Glu377的骨架羰基上。

除了上面提到的IMiD之外，还开发了几种具有更高选择性和药物相似性的新型降解剂(图5)。CC-122和CC-220是BMS开发的下一代IMiD (图5)。这两种化合物都通过与CRBN E3连接酶结合，诱导多发性骨髓瘤(MM)细胞和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞中的转染因子IKZF1和IKZF3多泛素化[18]-[20]。CC-220与CRBN结合更紧密，在来那度胺敏感(H929)和来那度胺耐药的MM细胞(H929/LR)中表现出比泊马度胺更高的抗增殖和促凋亡活性。2016年，Mary E. Matyskiela等报道了一种新的MGCC-885 (图5)，它通过CRBN依赖性泛素化和G1到S相转换1 (GSPT1)的降解有效抑制急性髓系白血病肿瘤细胞的增殖[21]。CC-885的戊二酰亚胺环与CRBN之间的相互作用类似于IMiD (图6)。戊二酰胺环位于CRBN的tri-Trp口袋中，异吲吲哚酮环位于CRBN表面，并与GSPT1和CRBN相互作用(图6)。此外，CC-885的尿素部分和CRBN残基E377和H353存在额外的氢键，这加强了CC-885和CRBN之间的相互作用(图6)。同时，位于GSPT1结构域3的β折叠核心附近的末端甲基氯苯基环募集GSPT1蛋白。基于CC-885的结构，他们对二氧代异吲哚啉和末端甲基–氯–苯环进行了修饰，以探索分子胶结构与底物受体之间的构效关系[22]。令人兴奋的是，GSPT1和IKZF3等蛋白质的选择性降解可以通过结构修饰来实现。特别是，CC-885、CC-92480、CC-99282和CC-90009的衍生物可以分别诱导IKZF1/3和GSPT1降解(图5) [23]-[25]。2020年，Joel W Thompson的小组通过化学库筛选发现了两种新的CRBN调节剂CC-3060和CC-647，它们可以促进锌指和含有16 (ZBTB16)的BTB结构域的降解(图5) [26]。有趣的是，CC-3060或CC-647通过分别与C2H2 ZnF1和ZnF3结构域相互作用以诱导ZBTB16的降解，与CRBN/ZBTB16形成三元复合物。CFT7455 (图5)是由C4 Therapeutics开发的新型IMiD，它与CRBN的结合亲和力是泊马度胺的800~1600倍。CFT7455与CRBN结合的增加诱导Ikaros和Aiolos的UPS降解更有效[27]。临床前研究显示，CFT7455 1.5 h内降解了75%以上的Ikaros，并抑制了所有MM细胞系和H929细胞系(来那度胺耐药细胞系)的增殖。BTX-1188是一种新型口服IMiD，与CRBN连接酶具有很强的结合亲和力，可诱导多种蛋白UPS降解，包括GSPT1、Ikaros、Aiolos和CK1 [28]。

Figure 5. Target and structure of thalidomide derivatives

图5. 沙利度胺衍生物的靶标和结构

Figure 6. Interactions between DDB1 (pink), CRBN (green), GSPT1 (yellow), and CC-885 (PDB code: 5HXB)

图6. DDB1 (粉红色)、CRBN (绿色)、GSPT1 (黄色)和CC-885 (PDB代码：5HXB)之间的交互方案

3. 新型沙利度胺衍生物作为分子胶降解剂

随着越来越多IMiDs/CRBN底物被报道，近几年发展了几种新型沙利度胺衍生物作为分子胶降解剂。Joel W Thompson课题组报道了两种新的IMiDs CC-3060和CC-647，它们分别结合ZBTB16蛋白的两个锌指结合位点ZnF1和ZnF3促进ZBTB16蛋白的降解，可能成为急性早幼粒细胞白血病的一种新治疗策略。Bin Liu课题组报道了IMiDs CC-885诱导多发性骨髓瘤中CDK4的CRBN依赖性泛素化和降解[29]。另一种在CC-885结构基础上发展来的IMiDs CC-90009可以诱导CRL4CRBN选择性靶向GSPT1蛋白进行泛素化和蛋白酶体降解，迅速诱导AML细胞凋亡。[30]该化合物用2氟亚甲基替换了CC-885苯甲酰胺上的氮原子，增加了对GSPT1蛋白的选择性。

新型沙利度胺衍生物作为分子胶降解剂机制

2010年，Takumi Ito等发现CRBN是沙利度胺的主要靶点。虽然MG降解剂的概念直到2019年才被提出[31]，但一些早期的研究表明，沙利度胺及其类似物可以通过劫持CRBN E3连接酶来诱导靶细胞蛋白质的泛素化和降解(图7A)。IKZF1和IKZF3是多发性骨髓瘤中必不可少的转录因子。通过募集CRBN E3连接酶，leFnalidomide导致IKZF1和IKZF3的选择性泛素化和降解，从而抑制骨髓瘤细胞增殖。随后，酪蛋白激酶1A1 (CK1α)也被鉴定为IMiDs/CRL4^CRBN的底物蛋白。来那度胺诱导CRBN E3泛素连接酶对CK1α的泛素化，导致CK1α降解。已经鉴定出更多IMiDs/CRBN复合物的新底物，包括锌指蛋白91 (ZFP91)和斯帕尔特样转录因子4 (SALL4) [32]。SALL4在胚胎发育中起重要作用，它在胚胎干细胞(ESC)中富集并调节ESC的干性[33]-[35]。沙利度胺与CRBN E3连接酶结合，靶向SALL4，在人和兔细胞中实现泛素化和降解，从而促进其致畸性。

(A)

(B)

Figure 7. (A) IMiD induced substrate degradation; (B) The conformational change of CRBN from open to closed

图7. (A) IMiD诱导底物降解；(B) CRBN从开放到闭合的构象变化

Figure 8. The interaction scheme between thalidomide and Gallus gallus CRBN (PDB code: 4CI1)

图8. 沙利度胺和Gallus gallus CRBN之间的相互作用方案(PDB代码：4CI1)

先前报道的CRBN E3泛素连接酶的底物受体包含一个Cys2-His2 (C2H2)锌指(ZF)结构域，该结构域具有特征性的β-发夹基序。CRBN表面包含一个与C2H2 ZF结构域的整体形状相匹配的完整颏槽，这证明了具有相同药物-CRBN界面的ZF degrons的不同底物蛋白之间的相互作用[36]。CRBN构象的研究表明，新底物仅与闭合的CRBN构象稳定结合[37]。更重要的是，只有IMiD和TBD的结合才能触发CRBN变构后范围从开放构象到规范封闭构象(图7B)。通过形成疏水键和氢键相互作用，IMiDs的戊二酰亚胺环与TBD结合(图8)，TBD是CRBN表面的一个浅疏水口袋，由三个关键色氨酸残基(人CRBN中的Trp380、Trp386和Trp400)组成[38]。戊二酰胺羰基化合物和中间酰胺分别与CRBN残基His380和Trp382处于氢键距离。离域孤对电子将戊二酰胺氮与两个戊二酰胺羰基连接起来，并与Trp382共面(图8)。邻苯二甲酰位置的共羰基为His359贡献了水介导的氢键，His359将酞二醇环系统锚定在一起，以及Pro354脂肪族表面提供的堆叠相互作用(图8)。传感器回路的再折叠促进了CRBN开放到CRBN闭合的转变，而没有观察到中间体(图7B)。最后，底物被募集到CRBN封闭混合物中，用于随后的CRL4泛素化。随着越来越多的IMiDs/CRBN底物蛋白被鉴定出来，CRBN-沙利度胺类似物转录因子复合物的晶体结构已经得到解决。CK1 α通过位于激酶N叶中的β发夹环与CRBN-来那度胺结合，该环连接CK1 α β链2和3 [39]。该环内的残基与来那度胺的另一个溶剂暴露的邻苯二甲酰亚胺环相互作用，并接触来那度胺结合袋周围的CRBN残基(图7)。与PROTAC相比，三元复合物的稳定性不完全依赖于IMiD/底物和 CRBN/IMiD之间的直接分子间相互作用。预先存在的PPI也有助于三元复合物的形成[40]。CRBN的C端结构域和CK1的36-42 β发夹环之间有三个蛋白质蛋白氢键α，这是CRBN募集CK1 α的关键。氢键稳健性与CRBN/来那度胺/CK1 α复合物的稳定性之间应呈正相关[41]。来那度胺为预先存在的蛋白质–蛋白质氢键提供疏水屏蔽，加强界面处的氢键，并增加复合物的结构、动力学和热力学稳定性。

研究人员正试图通过修饰戊二酰胺的结构来获得更具竞争力的CRBN li gands。Marcus D. Hartmann的小组通过鉴定TBD和戊二酰胺之间的亲和力来研究CRBN和谷胱氨酸的构效关系含有琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、尿嘧啶、二氢尿嘧啶和几种内酰胺类的衍生物。酰亚胺环对于CRBN的配体结合TBD至关重要，5元环比4元或6元环具有更高的亲和力，而7元环太大而无法结合[42]。一项令人兴奋的研究揭示了酰亚胺诱导蛋白质CRBN依赖性泛素化和降解的必要性。戊二酰胺是一种内源degron，在CRBN的IMiDs结合域上被endoge nous底物生理识别。C-ter最小环状酰亚胺修饰是在易感的天冬酰胺和谷氨酰胺残基上随机产生的，由蛋白质损伤诱导，并保护生物体免受这种形式的蛋白质损伤。值得注意的是，C端环状酰亚胺degron的发现为降解酶的设计提供了非常有意义的指导。

4. 总结

“反应停”事件已经过去几十年，但医药学家从未停止对沙利度胺作用机制的研究。自2010年沙利度胺被鉴定与CRBN蛋白结合开始，就不断有沙利度胺/CRBN的作用底物被报道。随着“分子胶”概念的提出，一些可以特异性靶向降解某些底物蛋白的新型IMiDs被开发。这些新型IMiDs充当蛋白–蛋白分子胶的作用，利用沙利度胺的戊二酰亚胺部分募集CRBN E3泛素连接酶，导致某种底物蛋白的降解。相比于同样功能的PROTAC分子，“分子胶”分子量小，细胞渗透性好，合成成本低，有更好的发展前景。通过对沙利度胺邻苯二甲酰亚胺部分的改造，或许可以靶向不含锌指的转录因子，以使沙利度胺衍生物在肿瘤治疗中得到更广泛的应用。

NOTES

^*通讯作者。