1. 引言
恶性肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，例如乳腺癌，作为女性最常见的恶性肿瘤之一，乳腺癌新发病例数快速增长，在2020年取代了肺癌成为全球第一大癌症[1]。不同于正常细胞，肿瘤细胞的有丝分裂异常频繁而且不受控制，但其分裂繁殖过程离不开微管的作用[2]。由于微管在肿瘤细胞的生长和发育中起到非常关键的作用，特别是以其为靶标的药物秋水仙碱(Colchicine，图1)、紫杉醇、长春碱等在肿瘤临床治疗中的有效性，使得微管成为比较理想的抗肿瘤药物研究的靶点[3]。
然而，目前的微管蛋白抑制剂都是非特异性的，其生物活性不能再限定在特定肿瘤部位，对正常细胞和健康细胞也有毒性。这种非特异性会在癌症的治疗中引起严重的全身性副作用，例如心脏毒性和神经毒性，这大大限制了此类抑制剂的用药剂量和用药途径；同时，获得性耐药的产生，也极大地削弱了它们的临床治疗价值[4]。
康普瑞汀(Combretastatin A4，CA4，图1)具有顺式二苯乙烯结构，是一种很有研发前景的微管蛋白抑制剂，有良好的抗肿瘤效应[5]，但其体内分布无特异性也带来很多全身性副作用[4]。虽然近年来有很多对CA4进行结构修饰的研究，但均未克服靶向性差的缺陷[6]。
为了增强其靶向性，鉴于CA4的二苯乙烯核心结构以及其顺反异构体的活性变化，偶氮苯光开关是一个很好的修饰途径[7]。著名期刊《Cell》报道：将CA4改造为偶氮苯化合物PST-1 (即将C = C键更换为N = N键，图1)后，通常情况下以无生物活性但性质更稳定的反式(trans-)结构存在(inactive)；而在体内靶部位给予特定波长的光(390~430 nm)，就可以转化为具有活性的顺式(cis-)结构发挥作用(active) [8]。但进一步的研究发现：CA4的偶氮苯改造物PST-1即使在黑暗中仍有少量具有活性的顺式异构体存在[9]，这会在体内输送过程中给机体造成副作用。因而，有必要对该类CA4的偶氮化衍生物继续进行深入的研究。
左. 秋水仙碱及康普瑞汀CA4结构；右. CA4的偶氮化衍生物PST的光致异构
Figure 1. Structure of tubulin inhibitors reported in the literature [8]
图1. 文献报道的微管蛋白抑制剂[8]
炔基是药物结构中的常见基团，药物分子末端或内部的炔基可以模拟多种基团的结构和功能特征，如其π电子去能有效模拟芳香环，其极化的-CH部分作为弱的氢键供体可以模拟卤原子等；在一些化合物中引入炔基甚至能够优化药代动力学参数，也可进一步进行点击化学反应引入三唑环[10]。本文在分子对接的基础上，合成了几个新的含端炔基的CA4的偶氮化衍生物，并进行了初步的光致异构性能和抗增殖活性研究。
2. 实验部分
2.1. 化合物合成
以3,4,5-三甲氧基苯胺为起始原料，经过重氮化反应后，与邻炔丙氧基苯酚进行偶合，得到关键中间体AzO-OH；关键中间体进一步与碘甲烷、溴丙烷或溴代正丁烷在K2CO3存在下进行酚羟基的取代反应，得到产物AzO-Me，AzO-Pr，AzO-Bu。反应路线如下：
2.1.1. 关键中间体Azo-OH的合成
配有温度计和恒压滴液漏斗的干燥三口烧瓶中，加入称量好的3,4,5-三甲氧基苯胺0.183 g (10 mmol)和95%乙醇溶液5 ml，冷却至−10℃，搅拌溶解。自恒压滴液漏斗中慢慢滴加浓盐酸2 ml，控制反应液温度低于0℃。另外称取亚硝酸钠1.39 g (20 mmol)，配置成5 ml水溶液，置于冷却液中进行冷却。在滴加完浓盐酸后，以同样的步骤将其逐滴滴入反应液中，温度保持在0℃以下，滴加完毕，保温搅拌反应1 h。与此同时，称取氢氧化钠0.8 g溶于水5 ml中配置成氢氧化钠水溶液，加入量取好的2-炔丙氧基苯酚2.92 g (9 mmol)溶解，放置于冷却液中进行冷却至−10℃。搅拌完成后，将冷却好的苯酚/氢氧化钠水溶液按照同样步骤逐滴滴入重氮化反应液中，并保持温度0℃以下。滴加完毕后，将反应液PH调节至8，移除冷却液，将反应液放置在室温条件下搅拌反应2 h。完成后，酸化，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥过夜。减压浓缩，得橙黄色油状液体，静置后固化，直接用于下一步反应。1H-NMR (CDCl3, ppm): 7.20 (s, 2H, Ph), 6.55 (d, 2H, Ph), 3.95 (s, 6H, OCH3), 3.94 (s, 3H, OCH3). 13C-NMR (CDCl3, ppm): 158.7, 158.6, 156.1, 153.4, 149.2, 140.4, 100.5, 61.1, 56.2. MS: [M+H]+ = 343.10, [M+Na]+ = 365.07.
2.1.2. Azo-Me的合成
50 ml三口烧瓶加入中间体Azo-OH 0.55 g、碳酸钾0.3 g，DMF 2 ml，并加入过量的碘甲烷0.1 g，室温搅拌反应24 h。反应毕，加水10 ml，并用乙酸乙酯10ml萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥过夜。减压浓缩，并用乙酸乙酯进行重结晶，得棕黄色固体Azo-Me，收率72.3%。1H-NMR (CDCl3, ppm): 7.20 (s, 2H, Ph), 6.55 (d, 2H, Ph), 3.95 (s, 6H, OCH3), 3.94 (s, 3H, OCH3). 13C-NMR (CDCl3, ppm): 158.7, 158.6, 156.1, 153.4, 149.2, 140.4, 100.5, 61.1, 56.2. MS: [M+H]+ = 356。
2.1.3. Azo-Bu的合成
用上述同样的方法，用溴代正丁烷代替碘甲烷，得Azo-Bu，收率70.6%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ/ppm: 7.56 (td, J = 4.6, 2.2 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.94 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.78 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.05 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.86 (s, 1H), 3.50 (t, J = 6.7 Hz, 1H), 2.47 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 1.89 – 1.73 (m, 2H), 1.50 (s, 2H). MS: [M+H]+ = 398.
2.1.4. Azo-Pr的合成
用上述同样的方法，用溴丙烷代替碘甲烷，得Azo-Pr，收率71.9%。MS: [M+H]+ = 384。
2.2. 分子模拟
2.2.1. 蛋白结构的准备
通过Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)下载微管蛋白与CA4的晶体复合物结构(PDB ID: 5LYJ, X-ray, 2.4 Å)。下载之后手动删除配体分子及多余结构，仅保留晶体结构中1个α、β二聚体。
蛋白结构的准备由Discovery Studio 4.0 (DS4.0，BIOVIA公司)中Prepare Protein程序进行，程序设置默认。该程序会自动完成包括插入缺失的原子和残基、去除可变构象、添加Loop区并对Loop区进行能量优化、计算pK值、对结构进行质子化、添加CHARMM力场等。最终形成新的复合晶体结构5LYJ_prep，供分子对接使用。
2.2.2. 配体的准备
利用ChemDraw绘制小分子化合物的结构，直接复制到DS4.0的Molecular窗口中，并利用Full Minimization模块对小分子进行能量最小化，并添加CHARMM力场。
2.2.3. 分子对接
利用DS4.0中的CDOCKER模块进行，以前期准备好的复合晶体结构5LYJ_prep为目标对接蛋白，结合位点是以原小分子为中心、10Å为半径的球形区域。对接时参数按程序默认设置，主要包括随机构象产生、构象优化和模拟退火等。
2.2.4. ADME预测
所选配体的ADME (吸收、分布、代谢、排泄)和药物化学参数使用在线网络工具SwissADME (http://www.swissadme.ch/)来预测[11]。
2.3. 光致异构性能研究
精密称取目标产物，置10 mL的容量瓶A中，加色谱甲醇溶解，并定容。移取100 μL置10 mL容量瓶B中，用色谱甲醇定容，配得浓度为2 × 10−5 mol/L溶液。完毕后取容量瓶B的溶解1 mL分别置于6个不同的EP管中，并编号。将配制好的EP管于暗处放置12 h后，分别使用红光(620~630 nm)、黄光(580~585 nm)、绿光(520~530 nm)、蓝光(450~470 nm)、紫外光(405 nm)、紫外光(395 nm)照射，并于15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，8 h取出其中一管用HPLC检测顺式与反式结构比例变化(液相条件：C18反相柱，2.1 × 50 mm，1.9 μm；温度：35℃；流动相：乙腈/水 = 50:50，流速1 mL/min)，并记录数据。
2.4. 抗增殖活性研究
在标准细胞培养条件下，将HeLa细胞(作为人类宫颈腺癌的模型)和MCF-7细胞(乳腺癌的模型)维持在补充有10% FBS的DMEM/F12培养基中。将每孔3,000个细胞接种到两组96孔板中，并将细胞与一系列单独的化合物的稀释液重复三次，孵育四天。在四天的化合物处理过程中，一组细胞在黑暗中生长，而另一组细胞在脉冲紫外线下生长(390~410 nm，每0.5 h照射10秒)。在化合物处理结束时，将3-(4,5-二甲基硫唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)试剂添加到每个孔中，并在37℃与细胞温育1小时。然后使用DMSO溶解在每个96孔中形成的晶体。使用BioTek Synergy H4 (BioTek Instruments, Winooski, VT)在波长570 nm和630 nm处测量光密度值，并使用这两个光密度值的差异来分析每个96孔中的相对细胞存活率。IC50值是通过Graphpad Prism软件使用S型剂量响应图来计算的。
3. 结果与讨论
3.1. 分子对接
分子对接是目前计算机辅助药物设计的一种常用且有效的方法，可指导我们筛选在蛋白质活性位点上具有良好适应性的化合物，并揭示小分子的理想结合方式。CDOCKER程序为具有单个靶蛋白的众多配体提供了精炼对接方式，这种基于网格的对接方法利用了CHARMm力场，其中蛋白质保持固定状态，同时允许配体变换构象，以-CDOCKER能和-CDOCKER相互作用能获得结果，其值越高，蛋白质与配体之间的有利结合越大[12]。
Figure 2. Left. Superimposition of the best scored conformation (green) and the original ligand conformation (black); Right. Protein-ligand interaction of CA4
图2. 左. 打分最佳的构象(绿)与原配体构象(黑)的叠合图；右. 蛋白–配体相互作用
为了验证对接方法的可靠性，首先将原来的配体小分子CA4与5LYJ_prep进行了分子对接。由图2可见，其中，打分最佳的构象与原蛋白结构中配体构象基本一致，为顺式结构，RMSD为0.6369Å，说明这种对接方法具有较高的重现性。因而，在后续的对接过程中，可以认为打分较高的构象(最优构象)具有较高的可信度。蛋白–配体相互作用显示：CA4最优构象中的两个苯环分别与微管蛋白的Cys241、Leu248、Ala250、Ala316及Ala258等残基形成非键相互作用，稳定了顺式构象；虽然也有几个弱的氢键存在，但均为O原子与烷基上的H原子所形成的，并没有强的氢键形成(图2)。按上述同样的方法，将设计的化合物与处理后的微管蛋白(5LYJ_prep)进行对接，以确定目标化合物对微管蛋白仍然保持较好的亲合性。对接结果如图3所示。
可见，按-CDocker_Interaction_Energy排序，Azo-Bu、Azo-Pr均有多个构象打分比原蛋白小分子CA-4 (图中显示其结合蛋白的名称5LYJ)高，且排名靠前的构象均与原蛋白中的小分子构象一致，为顺式结构，表明设计的化合物可能具有与CA-4类似或更强的微管蛋白抑制作用。
Figure 3. Molecular docking diagram of compounds and protein (a) and partial enlarged view (b)
图3. 化合物与蛋白的分子对接图(图a)及局部放大图(图b)
Azo-Pr打分最佳的构象与蛋白的相互作用显示，最优构象中的两个苯环中，A环与微管蛋白的Cys241、Leu248、Ala250、Ala316等残基形成非键相互作用，与cis-CA4非常一致；但B环则与Ala316、Lys352残基形成非键相互作用，由于引入的丙炔是直线型，引起蛋白残基变化，与Thr179形成了氢键作用，使其结合能量大大降低(图4)。Azo-Bu的情况也类似(图5)，但它的B环分别与Leu258、Ala316、Lys352残基形成非键相互作用，炔基与Ly2352、Thr179形成非键相互作用，共同稳定了结合构型。
Figure 4. Protein-ligand interaction of Azo-Pr
图4. Azo-Pr与蛋白的相互作用
Figure 5. Protein-ligand interaction of Azo-Bu
图5. Azo-Bu与蛋白的相互作用
同时发现：无论Azo-Bu、Azo-Pr还是原来的小分子CA-4，均在活性空腔中占据较小的一部分，如图6所示。据文献报道，CA-4所结合的微管蛋白的活性腔位于微管蛋白α/β异二聚体的界面接合处，称为秋水仙碱活性腔，它可分为1、2和3三个区域，1区位于α-微管蛋白表面，2区位于β-微管蛋白的表面，而3区位于β-微管蛋白的较深部位[13]。目前报道的同时占据秋水仙碱活性腔中三个区域的微管蛋白抑制剂比较少，最早报道的是ABT-751 [14]，而Azo-Bu、Azo-Pr的“芳香环–桥–芳香环”结构呈顺式构型，形成蝴蝶状空间构象，环A和环B分别占据秋水仙碱域的2区和1区，这与CA-4的晶体结构相一致。由于β微管蛋白具有多个亚型，其同种亚型在第2区和第3区的几个残基存在不同，因而若能同时结合到活性腔的三个区域，可能具有针对微管蛋白亚型的特异性靶向，从而可能降低总体毒性[15]。从这个意义上，Azo-Bu、Azo-Pr还有较大的结构改造空间。
Figure 6. The position occupied by Azo-Pr in the active cavity
图6. Azo-Pr在活性腔中占据的位置
3.2. ADME预测
SwissADME是一个网络工具，可从SMILES公式开始计算化合物的物理化学参数，其药代动力学特征，相似性和药用化学，预测的准确度在72%至94%之间[11]。生物利用度雷达是六边形形式的分析化合物的药物相似图，每个顶点代表定义生物利用药物的参数(亲脂性，大小，极性，溶解度，柔韧性和饱和度)；粉色区域是适合口服生物利用度的物理化学空间；以红色扭曲的六边形表示的分子的雷达图落在粉红色区域才能被视为具类药性[16]。从图7的雷达图中可见，化合物Azo-Bu、Azo-Pr总体上具有较好的口服生物利用度，但分子的柔韧性上还存在些许缺陷。
Bioavailability radars for the analyzed compounds, from the SwissADME web tool. LIPO = lipophilicity (XLOGP3 between −0.7 and 5.0); SIZE (Molecular weight between 150 and 500 g/mol); POLAR = polarity (TPSA between 20 and 130 Å2); INSOLU = solubility (Log S not higher than 6); INSATU = saturation (Fraction of carbons in the sp3 hybridization not less than 0.25); FLEX = flexibility (No more than nine rotatable bonds).
Figure 7. The bioavailability radar chart predicted by SwissADME
图7. SwissADME预测的生物利用度雷达图
3.3. 化学合成
重氮化–偶合反应(Diazotization coupling reaction)是合成偶氮类化合物的常用方法，包括重氮化反应与偶合反应两部分，常用一锅法连续进行[17]。重氮化反应中由于浓盐酸的加入，散发出大量的热能，稍不注意就会温度过高，所以在控制温度时不仅要保证散热源制冷器的正常运作，还要控制浓盐酸的滴加速度，以保证其产热在可控范围内。其次，亚硝酸钠也需要在整个实验过程中保证过量，若用量不足也会引起自偶合反应的发生，本实验中，要求亚硝酸钠的量为理论值的1.1倍左右。在偶合反应中，一般需要在弱碱环境中进行，弱碱环境可以使酚转化为苯氧负离子，从而使芳环活性增强，更易发生亲电反应。若是碱性过强，即PH大于10，重氮盐便会转化变成重氮碱，导致一系列副反应的产生。经过实验摸索，本实验偶合反应应在PH值7~8的弱碱性环境下反应较好。
通过对合成条件的探索与控制，成功获得目标化合物，其结构经NMR、MS等确证。
3.4. 光致异构现象研究
偶氮类化合物一般均具有很强的光致异构性能[7]。对其中一个偶氮化合物Azo-Bu避光12 h后(0 min)，按设置条件在不同波长的光照射不同时间后，随即用HPLC进行检测。以405 nm波长照射0、15、60 min的谱图如图8所示：
a: 0 min, b: 15 min, c: 60 min.
Figure 8. HPLC spectrum of 0, 15, 60 min under 405 nm wavelength of light
图8. 波长405 nm光照0、15、60 min后的HPLC谱图
其它实验操作相同。结果汇总见表1。
偶氮苯类化合物含有特殊共轭π化学结构，因而具有光致异构性能，即：可在特殊波段的光照射后，反式异构体与顺式异构体可以相互转化[8]。上述结果可见，在我们的实验中，不同波长的光对此类偶氮化合物的作用效果不一样。当暴露于红光(620~630 nm)、黄光(580~585 nm)、绿光(520~530 nm)、蓝光(450~470 nm)下，Azo-Bu的顺/反式结构仅存在少量互变；即使延长照射时长，也无法进一步引起反式结构向顺式结构进一步转变。而在395 nm与405 nm的紫外光照射下，可明显引起其反式结构向顺式结构的转化，随着延长照射时长，顺式结构的比例增多。这说明此类偶氮化合物可在一定波长光照下发生光致异构现象。但其转化的效果并未如文献[8]报道那样大部分或完全转化，具体原因正在进一步探究中。
Table 1. The content of cis/trans isomers under different wavelengths of light (%)
表1. 不同波长光照下Azo-Bu顺/反异构体的含量(%)
光照时长 波长 |
构型 |
0 min |
15 min |
30 min |
1 h |
2 h |
4 h |
8 h |
620~630 nm |
顺式 |
7.06 |
5.40 |
6.99 |
6.31 |
1.93 |
6.80 |
5.05 |
反式 |
92.94 |
94.60 |
93.01 |
93.69 |
98.07 |
93.20 |
94.45 |
580~585 nm |
顺式 |
4.36 |
2.75 |
1.78 |
1.56 |
1.83 |
1.06 |
0.73 |
反式 |
95.64 |
97.25 |
98.22 |
98.44 |
98.17 |
98.94 |
99.27 |
520~530 nm |
顺式 |
3.38 |
1. 40 |
0 |
1.03 |
1.70 |
2.80 |
1.25 |
反式 |
96.62 |
98.60 |
100 |
98.97 |
98.30 |
97.20 |
98.75 |
450~470 nm |
顺式 |
5.57 |
3.92 |
0.73 |
1.25 |
3.70 |
3.66 |
3.75 |
反式 |
94.43 |
96.08 |
99.27 |
98.75 |
96.30 |
96.34 |
96.25 |
405 nm |
顺式 |
4.83 |
8.48 |
15.03 |
22.03 |
26.05 |
25.92 |
26.62 |
反式 |
95.17 |
91.52 |
74.97 |
77.97 |
73.95 |
74.08 |
73.38 |
395 nm |
顺式 |
3.64 |
29.94 |
28.80 |
26.79 |
26.10 |
27.66 |
46.30 |
反式 |
94.36 |
70.06 |
71.20 |
73.21 |
73.90 |
72.34 |
53.70 |
3.5. 小分子化合物的抗增殖活性
作为常用的微管蛋白抑制剂，CA4具有很好的抗活性细胞增殖作用[5]。将其改造成偶氮化衍生物后，初步的药理活性研究结果如表2所示：
Table 2. IC50 value under dark/light (390~410 nm)
表2. 在黑暗/紫外光照(390~410 nm)下的IC50值
Compound |
Hela细胞(µM) |
MCF-7细胞(µM) |
黑暗 |
光照 |
光照/黑暗倍数 |
黑暗 |
光照 |
光照/黑暗倍数 |
Azo-OH |
31 ± 3 |
0.46 ± 0.06 |
67 |
50 ± 6 |
2.16 ± 0.10 |
23 |
Azo-Me |
50 ± 2 |
0.34 ± 0.06 |
147 |
70 ± 1 |
1.94 ± 0.12 |
36 |
Azo-Pr |
65 ± 4 |
0.21 ± 0.02 |
310 |
89 ± 7 |
0.82 ± 0.09 |
109 |
Azo-Bu |
/a |
0.06 ± 0.01 |
|
/a |
0.52 ± 0.08 |
|
CA4 |
1.2 ± 0.1 |
|
0.65 ± 0.04 |
|
a在实验测试浓度(0.001~100 µM)内未检测到。
可见，该类小分子偶氮化合物在黑暗中与在特定波长光照两种情况下表现出完全不同的细胞增殖抑制活性：在黑暗中显示出较差的活性(均远大于10 µM，甚至Azo-Bu化合物活性超出给药上限100 µM)，这是因为此时分子构型为较稳定的反式，不表现出生物活性；而在390~410 nm光照下，化合物由反式转变为有活性的顺式构型，表现出较好的生物活性，以Azo-Pr为例，在Hela细胞系中活性提高300多倍，在MCF-7细胞系中活性提高100多倍。
4. 结论
本文引入炔基，设计并合成得到3个CA4的偶氮化衍生物，其结构经NMR、MS确证。分子对接表明，该类化合物与微管蛋白具有较强的结合性，其结合模式与顺式CA4相近，因而可能具有类似或更强的微管蛋白抑制作用。光学性能研究发现，该类偶氮化合物在390~410 nm波长光照下会发生反--->顺的构型变化，表现出较好的生物活性。这种光致异构性能的存在，使该类CA4的偶氮化衍生物具备了潜在的医药用途，即通常情况下以无生物活性但性质更稳定的反式结构存在，而在体内靶部位给予特定波段的光，就可以转化为具有活性的顺式结构发挥作用，从而可以实现“全身给药，局部激活”的靶向性能，加强了CA4的靶向性。而细胞增殖抑制实验的结果也初步证实了上述设想，反式结构基本无活性，而其活性在特定波长的光照后大大提高。
基金项目
浙江省大学生科技创新活动计划(新苗人才计划) (编号：2024R424A009)、浙江省大学生创新创业训练计划项目(编号：S202213023047，S202413023055)资助。
NOTES
*通讯作者。