1. 引言
痛风常发病较急，多在早晨发作，表现为关节疼痛、畸形和活动障碍并伴随剧痛。这是由于体内尿酸水平过高排出异常或嘌呤代谢紊乱所致，导致血液中的尿酸以单钠尿酸盐晶体的形式在关节、皮下以及肾脏中沉积[1]。严重病例可能会导致肾功能损害和肾结石[2]。研究发现，肥胖、高血压、糖尿病等疾病会引起或加重痛风。痛风在全球呈现一个持续上涨的趋势，男性发病率高于女性[3]，伴随着经济的快速发展，在未来将面临着巨大的经济负担[4]。据统计数据显示，截至2019年，在中国，男性患病率高达12.3‰，而女性则为3.95‰ [5]，且呈年轻化趋势发展[6]。因此，痛风是一个巨大的公共卫生问题。
楤木又叫刺脑包、鹊不踏、老虎刺等。楤木属系五加科植物。我国是最早使用楤木的国家，早在古书中已有记述，如“今山中亦有之。树顶丛生叶，山人采食，谓之鹊不踏，以其多刺而无枝故也。”“山人折取头茹食之，亦治冷气。”等。楤木主要生长在黄河流域以南至南岭山地的各省区，蕴藏着极为丰富的种质资源。楤木是一种药食同源的植物，楤木根皮和茎皮均可入药[7]，具有治疗关节炎、祛风除湿、利水消肿、跌打损伤、风湿痹痛、行气活血、解毒消肿等功效[8]。目前，楤木作为一种传统的中药材，对于治疗痛风的作用机制和核心成分尚未完全清楚，因此本研究采用了网络药理学的研究方法和分子对接技术，旨在对楤木治疗痛风的成分进行预测和分析，为在临床及后期实验提供理论基础。
2. 材料和方法
2.1. 楤木活性成分及靶点筛选
通过查阅中国知网及万方等数据库，对楤木的化学成分进行系统收集。把收集到的成分通过PubChem数据库或中药系统药理学分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology, TCMSP)获得sdf或mol2结构文件，然后利用PharmMapper数据库[9]-[11]对各个组分的作用靶点进行解析，并以Norm Fit ≥ 0.9作为筛选标准，获得相应靶点。最后，基于Uniprot数据库，把各个靶点对应的活性成分进行标准化处理。运用Cytoscape 3.9.1构建“药物–活性成分–靶点”网络图。
2.2. 痛风疾病靶点筛选
通过DisGeNET数据库和GeneCards数据库，以“gout、gouty arthritis”为关键词，检索与痛风相关的靶点，导入Excel表格中共有2101个相关基因，删除重复数据532个，剩余1569个相关基因，即完成痛风相关疾病基因的搜集。将疾病靶点与活性成分靶点上传到Venny2.1软件分析，获得二者共同作用的靶点。
2.3. 楤木调控痛风基因靶点筛选
将使用Venny2.1软件获得的交集靶点导入Cytoscape3.9.1软件绘制“药物–疾病–靶点”的可视化分析网络图。
2.4. 楤木调控痛风关键靶点PPI网络图的构建
将交集靶点导入String数据库[12]，选择物种为人类(Human Sapiens)，设置置信度 ≥ 0.4，构建并分析靶点蛋白相互作用的网络，获得靶点之间的相互关系，隐藏无相互作用的靶点，将STRING得到的蛋白相互作用结果图和STV格式的文件导出，导入Cytoscape 3. 9.1 [13]软件进行可视化分析，得到楤木治疗痛风相关靶点的蛋白互作(protein-protein interaction networks, PPI)网络，并使用CytoHubba插件进行拓扑分析，分析参数为度值(Degree)、边缘渗透组件(edge percolated component, EPC)和最大团中心性(maximum clique centrality, MCC) [14]。将获得的关键靶标点按照MCC从高到低排序，得到10个hub基因。再利用MCODE插件识别PPI网络中连接密集的区域，分配给模块的分数反映了模块相对于周围节点的密度，分数越高表明模块中节点的重要性越高[13]。
2.5. 楤木调控痛风作用靶点GO和KEGG通路富集分析
将所有楤木调控痛风关键靶点输入至DAVID在线分析数据库，进行GO功能和KEGG通路富集统计图，选取GO富集分析结果前10的主要生物过程(biological process, BP)，细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)，KEGG中选取P < 0.05的通路，运用微生信绘制柱状图和信号通路气泡图，以探讨楤木调控痛风关键靶点在基因功能和信号通路中的作用。
2.6. 分子对接
将“药物–活性成分–靶点”图中排名前5的活性成分与PPI网络中筛选到的靶基因进行分子对接。从PubChem的数据库中下载SDF格式的小分子药物，从RCSB PDB数据库(rcsb.org)下载蛋白质，用OpenBabel3.1.1软件将SDF格式文件转化为PDB格式文件。利用Auto Dock Tools-1.5.6软件对蛋白进行去水、加氢原子、能量最小化、确定扭转键等处理，然后使用“Autodock”进行活性位点对接，并使用Actodock Vina [15]算法计算结合能，最后利用PyMOL软件进行可视化分析。
3. 结果
3.1. 楤木活性成分及靶点筛选
通过全面查阅相关数据库共获得109个楤木成分。将收集到的成分进行处理后，共获得有效成分34个(表1)。通过PharmMapper数据库对这些成分进行分析得到靶点共475个，去掉重复的378后，剩余97个靶点。使用Cytoscape 3.9.1构建“药物–活性成分–靶点”网络图(图1)。
Table 1. Chemical constituents of Aralia chinensis
表1. 楤木的化学成分
编号 |
化合物名称 |
文献来源 |
编号 |
化合物名称 |
文献来源 |
CM1 |
pimaric acid |
[16] |
CM18 |
Docosanoic acid |
[16] |
CM2 |
Kaurenoic acid (ent-kaur-16-en-19-oic-acid) |
[16] |
CM19 |
Palmitic acid |
[16] |
CM3 |
Kauralexin B2 |
[16] |
CM20 |
Daucosterol |
[16] |
CM4 |
Acanthol |
[16] |
CM21 |
Kaurenol |
[16] |
CM5 |
Caffeic acid |
[16] |
CM22 |
ethyl caffeate |
[17] |
CM6 |
Stigmasterol |
[16] |
CM23 |
trans-ferulic acid |
[17] |
CM7 |
Uridine |
[16] |
CM24 |
methyl caffeate |
[17] |
CM8 |
(-)-kaur-16-en-19-oic-acid |
[16] |
CM25 |
β-sitosterol |
[17] [18] |
CM9 |
17-hydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid |
[16] |
CM26 |
araloside A methyl ester |
[19] |
CM10 |
Hederagenin |
[16] |
CM27 |
taibaienoside I |
[19] |
CM11 |
ent-kaur-16-en-19-oic acid |
[16] |
CM28 |
Kaempferol |
[18] |
CM12 |
Myricadiol |
[16] |
CM29 |
Oleanolic acid |
[18] |
CM13 |
Taraxerol |
[16] |
CM30 |
Uridine monophosphate |
[18] |
CM14 |
Falcarindiol |
[16] |
CM31 |
Grasshopper ketone |
[20] |
CM15 |
Protocatechuic acid |
[16] |
CM32 |
Esculetin |
[20] |
CM16 |
Chlorogenic acid |
[16] |
CM33 |
Scoparone |
[20] |
CM17 |
Neochlorogenic acid |
[16] |
CM34 |
saponin |
[21] |
![]()
注：倒三角形代表药物名称、圆形代表靶点名、中间正方形代表活性成分，正方形节点越大说明该活性成分对应得靶点越多作用越大，排名前五的依次为Docosanoic acid、Caffeic acid、taibaienoside I、araloside A methyl ester、Palmitic acid。
Figure 1. Network diagram of “Drug-Active Ingredient-Target”
图1. “药物–活性成分–靶点”网络图
3.2. 痛风疾病靶点筛选
通过在disgenet数据库和GeneCards数据库中检索“gout和gouty arthritis”，最终得到1569个相关靶点，将疾病靶点与活性成分靶点取交集，使用Venny2.1制作韦恩图，最终发现33个交集靶点(图2)。
Figure 2. Venn diagram of targets for active ingredients in Aralia chinensis and gout-related targets
图2. 楤木活性成分靶点与痛风相关靶点韦恩图
3.3. “药物–疾病–靶点”网络图
使用Cytoscape 3.9.1对33个交集靶点绘制“药物–疾病–靶点”网络图(图3)。根据度值排序排在前五的依次为二十二烷酸(docosanoic acid)、咖啡酸(caffeic acid)、胡萝卜苷(daucosterol)、太白楤木皂苷I (taibaienoside I)和齐墩果酸(oleanolic acid)，这些成分可能是楤木调控痛风的核心成分(表2)。
注：左边方形代表药物的各个组分，右边的圆形图标代表疾病与药物的交集靶点。图形的大小由degree值决定，degree值越大图形越大。
Figure 3. Network diagram of “Drug-Disease-Target”
图3. “药物–疾病–靶点”网络图
Table 2. Degree values of the main active ingredients of Aralia chinensis
表2. 楤木主要的活性成分degree值
化合物名称 |
Degree值 |
Docosanoic acid |
17 |
Caffeic acid |
12 |
Daucosterol |
10 |
taibaienoside I |
10 |
Oleanolic acid |
9 |
3.4. 楤木调控痛风关键靶点蛋白互作(PPI)网络图构建
在String数据库中输入33个相交靶点，选择物种“Homo sapiens”，设置置信度为 ≥ 0.4，去除两个没有相互作用的靶点，获得31个靶点，共涉及31个节点和110条边(图4)。最后以TSV格式的文件导出，并使用Cytoscape3.9.1软件打开生成PPI网络图(图5)。根据degree值进行排序，节点越大、颜色越深表示对痛风效果较大。CytoHubba插件按照MCC排序得出10个与疾病相关的hub基因，由高到低依次是白蛋白(albumin, ALB)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)、丝裂原活化蛋白激酶1 (mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1)、酪氨酸激酶(proto-oncogene tyrosine-protein kinase src, SRC)、磷脂酰肌醇结合蛋白A5 (annexin A5, ANXA5)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARΓ)、血管内皮生长因子受体(kinase insert domain receptor, KDR)、丝裂原活化蛋白激酶14 (mitogen-activated protein kinase 14, MAPK14)、雄激素受体(androgen receptor, AR)和细胞周期A2控制蛋白(cyclin A2, CCNA2) (图6)。利用MCODE插件对蛋白互作网络中的关键模块进行识别，得到了一个由10个节点、39条边组成，分数为8.667的模块(图7，MCODE1)。根据MCODE评分，该模块中10个节点分别是KDR、MAPK14、PPARΓ、MAPK1、SRC、ALB、ANXA5、EGFR、
Figure 4. Diagram of potential target regulation
图4. 潜在靶点调控网络图
Figure 5. Protein-protein interaction (PPI) network diagram
图5. PPI蛋白互作关系网络图
Figure 6. Hub genes of Aralia chinensis in treating gout
图6. 楤木治疗痛风的hub基因
MOCDE1 Score: 8.667 MOCDE2 Score: 4.000
Nodes: 10 Edges: 39 Nodes: 4 Edges: 6
Figure 7. PPI network modules identified by MCODE plugin
图7. MCODE插件筛选所得PPI网络模块
休克蛋白家族A (Hsp70)成员8 (heat shock protein family A (Hsp70) Member 8, HSPA8)和CCNA2。总体分析表明KDR、MAPK14、PPARΓ、MAPK1、SRC、ALB、ANXA5、EGFR和CCNA2在不同算法下被确定为关键靶点，表明他们在网络中的重要性。
3.5. GO功能富集分析
运用David数据库对楤木调控痛风相关靶点进行信号通路分析。在Upload列内将共有基因粘贴在列表内，第二步选择“OFFICIAL-GENE-SYMBO0L”和“Homo sapiens”，第三步选择“Gene List”，第四步点击“Submit List”得出结果，共获取345条GO条目，导入excel里，分别选取前10个条目运用微生信进行可视化处理绘制柱状图(图8)。
由图8可知，楤木调控痛风的靶点被功能注释到BP，CC和MF等3个部分。BP主要涉及信号转导(signal transduction)、凋亡过程的负向调节(negative regulation of apoptotic process)、对DNA模板的转录正向调节(positive regulation of transcription, DNA-templated)、对RNA聚合酶II启动子的转录正向调节(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)和细胞增殖的正向调节(positive regulation of cell proliferation)等117个条目；CC主要富集于细胞质(cytoplasm)、细胞溶液(cytosol)、细胞核(nucleus)、细胞外区域(extracellular region)和细胞外外泌体(extracellular exosome)等25个条目；MF主要体现在蛋白质结合(protein binding)、ATP结合(ATP binding)、相同蛋白质结合(identical protein binding)、酶结合(enzyme binding)和受体结合(receptor binding)等34个条目。
Figure 8. GO enrichment of key target genes regulated by Aralia chinensis in treating gout
图8. 楤木调控认痛风的关键靶点的GO富集分析
3.6. KEGG通路分析
利用DAVID在线数据库对楤木调控痛风靶点进行KEGG通路富集分析，选取KEGG富集显著性P < 0.05的通路绘制气泡图(图9)。楤木调控痛风靶点涉及多条信号通路，主要涉及IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、Rap1信号通路(Rap1 signaling pathway)、VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)、癌症蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)和TNF信号通路(TNF signaling pathway)等54条通路。
3.7. 分子对接结果
将“药物–活性成分–靶点”网络图中排列前5的活性成分分别与PPI网络中筛选出的9个核心蛋白(KDR, MAPK14, PPARΓ, MAPK1, SRC, ALB, ANXA5, EGFR, CCNA2)进行对接。对接盒子x、y、z值均为126，中心值x、y、z分别为2.669、−19.932、8.838。一般认为，配体与分子受体结合的构象稳定时，结合能<0 kcal·mol−1，结合能越低则配体与分子受体发生作用的可能性也越大(表3)。分子对接展示结合能力最强的前4个结果以三维图形式展示(图10)。由表3可知，所有对接结果都<0 kcal·mol−1，表示具有较好的结合效果[22]，可见核心成分与核心靶点之间能够良好的结合，证实楤木具有一定的调节痛风的功效。另外核心成分taibaienoside I和核心靶点SRC结合能力为−12.9 kcal/mol是所有对接结果中最小的结果，说明taibaienoside I也许能够通过作用于SRC起到治疗痛风的效果。
Figure 9. KEGG enrichment of key target genes regulated by Aralia chinensis in treating gout
图9. 楤木调控痛风的关键靶点的KEGG富集分析
Table 3. Docking binding energy of key active components of Aralia chinensis with core target genes
表3. 楤木关键活性成分与核心靶点的对接结合能
化合物名称 |
结合能/kcalv·mol−1 |
KDR |
MAPK14 |
PPARΓ |
MAPK1 |
SRC |
ALB |
ANXA5 |
EGFR |
CCNA2 |
Docosanoic acid |
−7.9 |
−8.1 |
−5.2 |
−5.4 |
−6.0 |
−8.8 |
−5.7 |
−7.6 |
−6.6 |
Caffeic acid |
−6.3 |
−5.7 |
−6.5 |
−6.4 |
−6.2 |
−6.0 |
−7.4 |
−6.4 |
−6.2 |
Daucosterol |
−9.5 |
−7.2 |
−6.9 |
−7.4 |
−8.7 |
−8.4 |
−6.8 |
−9.1 |
−8.8 |
taibaienoside I |
−9.4 |
−9.9 |
−9.3 |
−10.7 |
−12.9 |
−11.0 |
−11.9 |
−11.7 |
−12.2 |
Oleanolic acid |
−8.2 |
−7.7 |
−6.4 |
−7.1 |
−8.7 |
−7.4 |
−7.3 |
−8.1 |
−9.3 |
(A1) SRC与taibaienoside I分子对接结果 (A2) CCNA2与taibaienoside I分子对接结果
(A3) ANXA5与taibaienoside I分子对接结果 (A4) EGFR与taibaienoside I分子对接结果
注：图中紫色表示核心成分的小分子，绿色标识表示氨基酸残基及名称代码、黄色虚线表示氢键及距离。
Figure 10. Diagrams of the top four docking with the strongest binding affinity
图10. 结合能力最强的前4个对接图
4. 讨论
本研究应用网络药理学结合分子对接技术，对楤木治疗痛风的作用机制进行了初步的讨论。经多个数据库的搜索，共获得109个活性成分，预测得到475个潜在靶点。通过构建“药物–疾病–靶点”网络时，发现docosanoic acid、caffeic acid、daucosterol、taibaienoside I、oleanolic acid的Dgree数值均较大，在网络中作用明显，表明这5个成分可能是楤木治疗痛风的主要物质基础。
通过PPI蛋白互作关系网络进行拓扑分析，得出KDR、MAPK14、PPARΓ、MAPK1、SRC、ALB、ANXA5、EGFR、CCNA2可能是楤木治疗痛风的关键靶点。其中ANXA5通过影响细胞因子环境的稳定来发挥作用。它与炎症因子如TNF-α之间存在相互作用，调节巨噬细胞的正常功能，并对巨噬细胞分泌的抗炎细胞因子IL-10的水平产生影响。一旦ANXA5功能受损时，就会导致或加剧炎症反应的发生[23]。MAPKs信号通路是痛风的关键致病机制之一[24]。在该通路中，MAPK1 (又称为ERK2)与TNF-α信号传导紧密关联。研究表明，当TNF-α与滑膜成纤维细胞相互作用时，会激活ERK2。随后，激活的ERK2转移至细胞核，进而促进IL-8基因的转录和表达。加剧了痛风关节的炎症反应和病理变化[25]。另一方面，MAPK14作为MAPK家族的重要成员，受外界刺激后可活化p38 MAPK通路，启动炎症级联反应[26]。
活化的p38 MAPK蛋白可以通过磷酸化其下游的蛋白激酶以及转录因子，促进炎症介质如TNF-α、IL-2、IL-4的表达，进而诱导细胞凋亡和炎症反应[27]。PPARγ通过调节多个基因的表达，参与调控机体的生理和病理过程，抑制炎症信号通路和炎症介质的生成[28]，具有抗炎镇痛的作用[29]。在痛风的炎症期间，中性粒细胞受到尿酸盐结晶的刺激后会快速激活PI3K/Akt、p38 MAPK和ERK通路，引起一系列细胞信号传导事件。在研究中发现，Src激酶是调控中性粒细胞对尿酸盐晶体的反应起到关键作用，当Src被抑制时，p38 MAPK的磷酸化有明显的变化。另外，Syk和Src家族酪氨酸激酶也被报道可以影响中性粒细胞的反应，其中Src家族激酶主要参与了p38 MAPK的激活过程[30]。EGFR信号的活性下降加速了关节软骨结缔组织的退变和损伤，同时促进了软骨和骨骼的侵蚀，影响关节滑膜血管的健康。这涉及到细胞外基质中磷酸化的p38和EPK激酶激活丝裂原活化蛋白激酶，从而加速关节炎的发展和恶化[31]。CCNA2在S/G2期参与调控细胞周期。在炎症条件下，细胞可能会启动细胞周期停滞的机制，以应对炎症介质的影响，减少进一步的损伤和炎症反应。这种细胞周期的调控可能会影响痛风病变的发展和恢复[32]。对富集结果进行分析可知，楤木可能通过IL-17、TNF、Rap1、VEGF和AGE-RAGE信号通路等发挥治疗痛风的作用。
楤木活性成分的核心作用靶点比楤木多糖更多，而楤木多糖影响痛风的靶点与活性成分之间分子对接的结合能普遍大于楤木活性成分的对接结合能[33]，提示楤木作为一个整体其潜在的作用更大。生物活性物质的提取等加工过程属于广义的烹饪，无论是环境营养学角度还是烹饪医学角度，都应该优先将楤木作为一个整体来加以利用[34] [35]。在楤木的根皮和茎皮中咖啡酸的含量分别达到了0.28%和0.16% [36]。咖啡酸抑制黄嘌呤氧化酶的活性来减少体内尿酸水平，进而有助于缓解痛风症状[37] [38]。楤木还含有一种名为胡萝卜苷的活性成分，它具有显著的抗炎功效。研究表明，胡萝卜苷能够提升谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的水平，并降低丙二醛(malondialdehyde, MDA)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β (interleukin-1beta, IL-1β)和白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)的水平。这些改变被认为是有助于减少炎症反应和氧化应激的因素[39]。齐墩果酸在楤木的根皮和干皮中的含量分别为5.56%和7.74% [40]。齐墩果酸对关节滑膜组织的炎症反应具有显著改善作用。众所周知，关节滑膜是痛风炎症的主要发生场所之一，当关节受到炎症的侵袭时，会出现关节疼痛和肿胀。因此，通过缓解关节滑膜组织炎症反应，齐墩果酸可以作为一种潜在的治疗手段来缓解痛风带来的痛苦[41] [42]。研究发现，皂苷I在楤木中的含量在14.714~47.902 mg·g−1范围内[43]，太白楤木皂苷I通过抑制核因子kappa B通路，对痛风纤维样滑膜细胞发挥促凋亡和抗炎作用[44]。
楤木的活性成分通过抑制黄嘌呤氧化酶、减少炎症反应、改善关节滑膜组织状况等方式，有望减少尿酸水平、缓解痛风症状[45]。分子对接结合能分值小于−4.00且大于−7.00，则认为配体与靶点形成有效结合活性较好；≤−7.00，则认为配体与靶点结合活性更好。分子对接结合能表明，前述5个楤木活性化合物均可与关键靶点蛋白自发结合，且结合活性普遍较好。这为后续的药物开发提供了重要的理论依据。通过分子对接结合模式图的直观展示，可以清楚地看到楤木活性化合物主要通过氢键作用与靶蛋白发生相互作用。这些氢键不仅增强了它们之间的结合力，还可能参与到复杂的生物化学过程中。此外，分子对接结果也为楤木主要活性成分通过调控核心靶点来治疗痛风提供了强有力的证据。网络药理学的研究结果本已显示了楤木提取物在调控炎症反应方面的潜力，而分子对接的结果进一步证实了这一点。楤木活性成分之所以能够对核心蛋白表现出色的结合能力，很可能是因为它们针对痛风治疗所需的多靶点机制而设计的，这种多靶点、多途径的治疗策略赋予了楤木独特的治疗价值。
5. 结论
本研究运用网络药理学，通过构建复杂网络模型，成功预测了Docosanoic acid、Caffeic acid、Daucosterol、taibaienoside I和Oleanolic acid等关键化合物在治疗痛风方面的潜在贡献。此外，还系统地识别了KDR、MAPK14、PPARΓ、MAPK1、SRC、ALB、ANXA5、EGFR、CCNA2等多个潜在作用靶点，以及这些靶点所涉及的相关通路。最后利用分子对接技术验证以上靶点，发现这些靶点和主要活性成分能够很好的结合。本研究在一定程度上阐明了楤木治疗痛风的潜在机制，为后续的实验研究奠定了基础。
基金项目
广西中医药大学校级重点项目(2021ZD004)；广西壮族自治区大学生创新创业训练计划项目
(S202310600103)。
NOTES
*共同第一作者。
#通讯作者。