1. 引言
在当今社会，随着人们生活节奏的加快和工作压力的增大，健康饮食逐渐成为人们关注的焦点。特别是针对具有抗氧化和降糖功能的食品，市场需求日益旺盛。这不仅体现了现代人对健康生活方式的追求，也反映了他们在应对生活压力时，对健康食品和功能性食品的迫切需求。
藜麦(Chenopodium quinoa Willd.)，亦称藜谷、南美藜或昆诺阿藜，作为一种隶属苋科藜亚科藜属的一年生双子叶植物，其原生地主要位于南美洲安第斯山脉的秘鲁、玻利维亚及厄瓜多尔，拥有悠久的栽培历史[1]。藜麦因富含多糖、蛋白质、脂肪、矿物质及维生素等多元营养成分，被联合国粮农组织(FAO)誉为“唯一全营养单体谷物”，被视为能够全面满足人体基本营养需求的理想食品[2]。山西静乐地区凭借其优越的自然条件，成为我国种植藜麦较早、面积较大、品质较优、模式较成功的种植基地，因而被誉为“中国藜麦之乡”[3]。
多糖，作为一类由至少10个单糖单元通过糖苷键紧密连接而成的复杂高分子碳水化合物，在自然界中广泛存在于植物体及微生物细胞壁中[4]。多糖展现了丰富的生物活性与多样的健康效应，包括但不限于抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、调节血糖及血脂水平，以及增强机体免疫功能[5]。尤其在抗氧化领域，多糖因其卓越的清除自由基能力而备受关注，它能够显著降低血浆中的丙二醛水平，这一指标通常与氧化应激程度正相关[6]，同时提升体内抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)，从而有效抵御氧化损伤[7]。
此外，多糖还通过多种途径发挥降血糖功能，包括调节肠道菌群结构、促进有益菌增殖、抑制有害菌生长、抑制胰岛素细胞凋亡、刺激胰岛素分泌、增强葡萄糖摄取和利用、促进肝糖原合成等机制[8]-[10]，这些作用共同构成了多糖在调节糖代谢过程中的重要地位。研究表明，藜麦多糖可以有效抑制α-淀粉酶活性，进而调控血糖水平[11]。鉴于植物多糖在体内通常需经过肠道微生物的复杂分解过程，转化为单糖后才能被人体或肠道菌群进一步吸收利用[12]，因此，深入探究藜麦多糖中构成其基础的单糖单元的独立生物活性，不仅是对藜麦多糖功能研究的必要延伸，也为未来产品开发提供了科学依据。
然而，尽管藜麦多糖的生物活性已得到广泛认可，但关于其组成单糖的功能性研究却相对较少。这一研究空白限制了我们对藜麦多糖健康机制的全面理解，也阻碍了其在功能性食品开发中的深入应用。因此，本研究在前人对藜麦多糖探索的基础上，进一步分离提取藜麦多糖，验证其体外抗氧化与降糖活性，并针对其组成中各标准单糖进行生物活性对比，旨在探究单糖是否可以独立产生抗氧化和α-淀粉酶抑制作用。这一研究不仅有助于深化对多糖活性机理的认识，也为藜麦多糖及单糖产品的开发提供了理论基础和科学依据。
2. 材料和方法
2.1. 试验材料
山西静乐白藜麦，山西亿隆藜麦开发股份有限公司。葡萄糖(AR级)，西陇科学股份有限公司。L-阿拉伯糖(HPLC级)，上海千盛生物科技有限公司。D-葡萄糖醛酸(AR级)，上海源叶生物科技有限公司。D-半乳糖醛酸(AR级)，3%双氧水，天津市众联化学试剂有限公司。DPPH• (2,2-联苯基-1-苦基肼基，AR级)，国药集团化学试剂北京有限公司。α-淀粉酶(BR级)，北京索莱宝科技有限公司。
2.2. 主要仪器与设备
DNM-9602酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司。UV-1800PC-DS2紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。RE-5203旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。SHB-III循环水式多用真空泵，上海振捷实验设备有限公司。
2.3. 试验方法
2.3.1. 藜麦多糖的提取
参考前人方法[13]，对藜麦进行预处理：挑选出饱满的籽粒，粉碎通过40目筛网筛选，确保粒度均匀。之后，在70℃条件下烘干处理。接下来，按照1:10 (m:v)的料液比，加入95%乙醇溶液，静置10小时进行初步提取。提取后，再次于60℃烘干备用。
按照1:30的料液比(m:v)加水配制成溶液，并使用氢氧化钠溶液调整pH值至8.0。加入原料质量3%的胰蛋白酶，在37℃恒温条件下提取1小时。为了灭活胰蛋白酶，将溶液煮沸10分钟。利用超声波辅助提取法，在540 W功率、63℃温度下处理20分钟，以增强多糖的释放。
提取液经过4000 r∙min−1离心15分钟，获取上清液。通过旋转蒸发对上清液进行浓缩，再向浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇，于4℃静置过夜以促进多糖沉淀。次日，再次以4000 r∙min−1离心15分钟，收集沉淀物。最后，将沉淀物溶解并定容至250 mL，得到藜麦多糖提取液。
2.3.2. 藜麦提取液活性成分含量测定
多糖含量测定：参考前人方法[14]，首先精确配制浓度为100 μg∙mL−1的葡萄糖标准溶液，储存于冰箱中备用。取0 (空白对照)、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL此溶液分别注入50 mL比色管，加水调整至总体积为2 mL。随后，向每管中加入1 mL 9%苯酚溶液并混匀，紧接着快速滴加5 mL浓硫酸，再次混匀。将比色管置于沸水浴中加热30分钟，随后冰浴冷却5分钟。利用紫外–可见分光光度计，在490 nm波长下测定各样品的吸光度，据此绘制标准曲线，其方程为y = 0.0131x − 0.007，相关系数R2 = 0.9983，表明线性关系良好。
测定时，先将1 mL样品提取液稀释至100 mL，再从中取0.4 mL稀释液，加水至总体积为2 mL，按照上述步骤测定其吸光度值。将测得的吸光度值代入标准曲线方程，计算出样品提取液中的多糖浓度。同时，根据多次测定结果计算相对标准偏差(RSD)，以评估数据的重现性和可靠性。
2.3.3. 藜麦多糖提取液抗氧化活性评价
配制好浓度为4 mg∙mL−1的Vc标准液，并将其存放于棕色瓶中以避免光照影响。随后，从该标准液中取出适量，通过2倍梯度的方法进行倍比稀释，即从4 mg∙mL−1的浓度开始，逐步稀释，共选取六个不同的浓度梯度。配制好的标准溶液置于4℃的冰箱中保存。
样品溶液的配制，首先将提取液调整至4 mg∙mL−1的浓度。与标准溶液的稀释方法相同，也采用2倍梯度的倍比稀释方式，连续进行稀释操作，直至达到六个不同的浓度梯度。完成稀释后，同样将这些样品溶液放置于4℃的冰箱内保存，以便后续实验使用。
DPPH•自由基清除试验：依据前人的方法略有改动[15]，精确称量80 mg DPPH•，随后使用无水乙醇作为溶剂，将其定容至500 mL。将配制好的DPPH•溶液转移至棕色瓶中，置于冰箱中保存。
在测定过程中，针对每个样品的不同梯度溶液，分别取2 mL，并加入同样体积的DPPH•溶液(即2 mL)，充分混合均匀后，将混合液放置于暗处静置30 min。随后，使用分光光度计在517 nm的波长下测定其吸光度值，记为D1。作为对比，还需测定仅由2 mL DPPH•溶液与2 mL蒸馏水混合后，在相同条件下暗处静置30 min的吸光度值，记为D0。此外，为了校正样品本身的吸光度，还需测定2 mL样品梯度溶液与2 mL蒸馏水混合后的吸光度值，记为D2。所有测定过程中，均使用超纯水进行调零，并确保每个实验条件均进行三次重复操作。其中，维生素C(Vc)作为阳性对照，其测定方法与样品溶液的测定方法完全一致。DPPH•清除率计算公式如下：
(1)
羟自由基清除试验：依据前人的方法略有改动[16]。配制7.5 mmol∙L−1双氧水溶液、7.5 mmol∙L−1 FeSO4水溶液、8.0 mmol∙L−1水杨酸–乙醇溶液，均棕色瓶4℃冰箱保存。
在测定时，每个样品梯度溶液1 mL，加入1.5 mL FeSO4溶液，3 mL水杨酸–乙醇溶液和3 mL 3%双氧水溶液，混匀后在37℃水浴下反应45 min，Vc为阳性对照，试验方法与样品溶液一致，均超纯水调零，做3组重复，测定510 nm处的吸光度值A1，水代替样品溶液反应后吸光度为A0，样品梯度溶液与7.5 mL水混合后的吸光度为对照组A2，羟自由基清除率计算公式如下：
(2)
2.3.4. 藜麦多糖提取液体外降糖活性评价
采用前人的方法略有改动[17]，根据碘–淀粉比色法测定提取液对α-淀粉酶的抑制活性。在2 mL离心管中各加入不同梯度样品提取液100 μL，再加入800 μL 0.5 g∙L−1淀粉溶液，于37℃温浴5 min后加入100 μL 0.05 mg∙mL−1 α-淀粉酶(溶剂为0.1 mol∙L−1 pH为7.0的磷酸钾缓冲液)，45℃反应 3 min后，加入800 μL 0.01 mol∙L−1碘液进行检测，酶标仪在660 nm处测定吸光值为Ai；酶以缓冲液代替，其余与反应管一致，反应后的吸光值记为A0，为Control组；样品用水代替，其余与反应管一致，吸光度记为AH，为空白组。采用下式计算α-淀粉酶活性抑制率：
(3)
2.3.5. 藜麦单糖抗氧化及体外降糖活性评价
配制各单糖标准品溶液：葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、葡萄糖醛酸(GlcA)和半乳糖醛酸(GalA)浓度均为2 mg∙mL−1，进行以下试验(n = 3)：
(1) 单糖DPPH•自由基和羟自由基清除试验
以2.3.3的方法进行试验，样品为各单糖标准品溶液，Vc为阳性对照。
(2) 单糖体外α-淀粉酶活性抑制试验
以2.3.4的方法进行试验，样品为各单糖标准品溶液。
2.3.6. 单糖量效关系验证试验
配制不同浓度的阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸样品溶液，以上述方法进行试验，检验其抗氧化、降糖效果与浓度之间的关系。
2.4. 统计分析
采用GraphPad Prism 10.2.3进行数据处理和绘图；采用方差分析多重比较(ANOVA Multiple Comparisons)进行各试验组之间的显著性检验，字母表示显著性差异，Duncan’s multiple range test (P < 0.05, n = 3)。
3. 结果与分析
3.1. 藜麦多糖体外抗氧化、降糖功能验证
本研究首先验证了前人关于藜麦多糖的体外抗氧化及降糖能力的论述，旨在为后续实验体系的可靠性奠定基础。
通过DPPH•自由基及羟自由基清除实验，评估了藜麦多糖的抗氧化性能。结果如图1(A)、图1(B)所示，与空白对照(0 mg∙mL−1)相比，藜麦多糖在各浓度下均显著(P < 0.05)提升了这两种自由基的清除能力，且效果随浓度递增而增强。在4 mg∙mL−1时，藜麦多糖的DPPH•自由基清除率与羟自由基清除率分别达到了13.26%与12.71%。
在降糖功能验证方面，本研究通过α-淀粉酶活性抑制实验，评估了藜麦多糖对α-淀粉酶活性的抑制效应。实验如图1(C)所示，藜麦多糖对α-淀粉酶活性具有显著的抑制效应，且抑制率随浓度增加而显著上升。在16 mg∙mL−1时，藜麦多糖的α-淀粉酶抑制率高达87.44%，显示出卓越的体外降糖活性。
以上结果不仅验证了前人关于藜麦多糖具备优秀抗氧化与降糖性能的论述，也为后续探究其组成单糖的抗氧化能力提供了实验依据。
注：不同处理组间小写字母不同代表结果差异显著(P < 0.05)。
Figure 1. Fluence of polysaccharide concentration on antioxidation and alpha-amylase inhibitory activity
图1. 多糖浓度对抗氧化和α-淀粉酶抑制活性影响
3.2. 单糖抗氧化、降糖能力探究
鉴于植物多糖在体内通常需经过肠道微生物的复杂分解过程，转化为单糖后才能被人体或肠道菌群进一步吸收利用[12] [18]，本研究进一步探究了藜麦多糖中组成单糖的抗氧化及降糖能力。结合前人的研究结果[16] [19] [20]，本实验共选取了藜麦多糖的8种组成单糖作为实验对象，分别是葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、葡萄糖醛酸(GlcA)和半乳糖醛酸(GalA)。
以各标准单糖为样品，测定了其DPPH•自由基及羟自由基清除率。结果如图2(A)、图2(B)所示，相比于其他单糖，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸在2 mg∙mL−1时表现出了显著的抗氧化能力(P < 0.05)。其中，葡萄糖醛酸的DPPH•自由基清除率和羟自由基清除率分别为10.27%和4.26%，而半乳糖醛酸的清除率则分别高达16.90%和98.32%。特别值得注意的是，半乳糖醛酸的羟自由基清除效果是同浓度葡萄糖醛酸清除率的23倍，接近阳性对照Vc的清除率。这一结果表明，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸在体外有良好的抗氧化能力，尤其是半乳糖醛酸，其抗氧化性能尤为突出。
在降糖能力探究方面，实验通过α-淀粉酶活性抑制实验，评估了各标准单糖对α-淀粉酶活性的抑制效应。结果如图2(C)所示，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸对α-淀粉酶活性具有显著的抑制效应，在2 mg∙mL−1时，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的α-淀粉酶抑制率分别为48.24%和55.14%，而相比之下，其他单糖如阿拉伯糖的抑制率则较低，仅为2.90%。这一结果表明，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸不仅具有良好的抗氧化能力，还具备显著的降糖能力。
注：不同处理组间小写字母不同代表结果差异显著(P < 0.05)。
Figure 2. Comparison of antioxidation and alpha-amylase inhibitory activities of different monosaccharides
图2. 不同单糖的抗氧化和α-淀粉酶抑制活性对比
3.3. 单糖量效关系验证试验结果
为进一步深入探究葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸这两种糖醛酸的体外抗氧化与降糖能力是否存在浓度效应，本研究进行了更为详尽的量效关系验证试验。考虑到阿拉伯糖在肥胖、二型糖尿病等代谢相关疾病中已有较为充分的研究[21]，本试验以阿拉伯糖为对照，通过设定不同浓度梯度，对这两种糖醛酸的抗氧化性能和α-淀粉酶抑制活性进行了系统评估。
在DPPH自由基清除试验中，结果如图3(A)所示，葡萄糖醛酸在0.08 mg∙mL−1、0.4 mg∙mL−1、2 mg∙mL−1浓度下的DPPH•自由基清除率分别为7.66%、8.75%、10.14%，清除率逐渐提升，但增幅相对较小。相比之下，半乳糖醛酸的清除率则表现出更为显著的浓度依赖性，其清除率从0.08 mg∙mL−1时的9.32%迅速提升至2 mg∙mL−1时的16.91%，增幅较大。结果表明，半乳糖醛酸在DPPH•自由基清除方面具有较高的活性，且其活性随浓度增加而显著增强。
羟自由基清除试验结果同样支持了葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸具有显著抗氧化活性的结论。结果如图3(B)所示，葡萄糖醛酸在0.08 mg∙mL−1、0.4 mg∙mL−1、2 mg∙mL−1浓度下的羟自由基清除率分别为1.72%、2.04%、4.21%，虽然清除率相对较低，但呈现出明显的浓度依赖性。半乳糖醛酸的清除率则更为突出，从0.08 mg∙mL−1时的22.12%迅速提升至2 mg∙mL−1时的98.30%，几乎接近阳性对照Vc的清除率(99.98%)。这一结果表明，半乳糖醛酸在羟自由基清除方面具有极高的活性，且其活性随浓度增加而显著增强。
注：不同处理组间小写字母不同代表结果差异显著(P < 0.05)。
Figure 3. The concentration of uronic acid affects the activity of antioxidation and alpha-amylase inhibition
图3. 糖醛酸浓度对抗氧化和α-淀粉酶抑制活性的影响
在α-淀粉酶抑制试验中，如图3(C)所示，葡萄糖醛酸在0.08 mg∙mL−1、0.4 mg∙mL−1、2 mg∙mL−1浓度下的α-淀粉酶抑制率分别为1.97%、38.38%、48.24%，抑制率随浓度增加而逐渐提升。半乳糖醛酸的抑制率则更为显著，从0.08 mg∙mL−1时的45.54%迅速提升至2 mg∙mL−1时的55.14%，表现出极强的α-淀粉酶抑制活性。这一结果表明，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸在调节糖代谢方面具有较高的潜力，能够通过抑制α-淀粉酶活性来减缓葡萄糖的释放速度，从而有助于血糖的稳定。
4. 结果与讨论
本研究通过体外实验系统评估了藜麦多糖及其组成单糖的抗氧化和降糖活性。结果显示，藜麦多糖在4 mg∙mL−1时对DPPH自由基和羟自由基的清除率分别为13.26%和12.71%，在16 mg∙mL−1时对α-淀粉酶的抑制率高达87.44%。这些结果表明藜麦多糖具有显著的抗氧化和降糖潜力。
进一步分析发现，藜麦多糖中的葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸是其主要活性成分。在2 mg∙mL−1时，半乳糖醛酸的羟自由基清除率高达98.32%，接近阳性对照维生素C，其α-淀粉酶抑制率为55.14%；而葡萄糖醛酸的DPPH自由基清除率为10.27%，α-淀粉酶抑制率为48.24%。量效关系实验表明，这两种单糖的抗氧化和降糖活性随浓度增加而显著增强，表现出明显的浓度依赖性。
从分子机制上看，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的活性可能与其化学结构密切相关。这两种单糖均含有丰富的羟基和羧基官能团，能够与自由基发生化学反应，从而中和自由基的活性，表现出显著的抗氧化能力。此外，这些官能团可能通过与α-淀粉酶的活性位点结合，形成氢键或静电相互作用，从而抑制酶的催化活性，延缓淀粉的消化和吸收，进而发挥降糖作用。这种机制与天然降糖抑制剂(如阿卡波糖)的作用方式类似。
近年来，糖醛酸与抗氧化、降糖活性间的关联日益受到重视。研究显示，伞形蓼中的多糖PUP80S1相较于PUP60S2，含有更丰富的糖醛酸残基，并展现出更强的抗氧化活性[22]。同样，姬松茸中的多糖ABMP-F和ABMP-V，因其高糖醛酸残基含量，在自由基清除能力上超越其他多糖[23]。这些发现虽初步揭示了糖醛酸单元对多糖功能性的潜在影响，却尚未充分探讨糖醛酸本身的应用潜力。从市场需求视角审视，抗氧化与降糖功能的食品在糖尿病、心血管疾病的预防与控制中展现出巨大潜力[24] [25]。然而，鉴于当前糖醛酸研究缺乏体内实验数据，直接摄入糖醛酸可能伴随安全风险。因此，对于肥胖或二型糖尿病患者而言，通过摄入如藜麦多糖这类含糖醛酸的多糖，或能成为管理疾病的可行方式。
尽管本研究主要基于体外实验，但这些发现为未来的体内实验和临床研究奠定了坚实基础。未来进一步验证这两种糖醛酸在体内的生物活性及其代谢机制，将有望揭示葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸在预防肥胖或糖尿病等代谢疾病中的应用潜力。我们希望在充分研究后，将这两种糖醛酸纳入食品与药物开发中，为肥胖或糖尿病等代谢疾病的预防与管理提供更多选项。
基金项目
全国生物技术职业教育教学指导委员会共同体建设研究项目(GTTXM202403)；北京农业职业学院科技创新项目(XY-YF-20-06)；北京农业职业学院学生双创项目(XY-XK-23-05)。
NOTES
*共同第一作者。
#通讯作者。