微量紫外–可见分光光度法测定阳离子脂质体中MicroRNA的含量
Determination of MicroRNA in Cationic Liposomes by Micro UV Spectrophotometry
摘要: 目的：建立以硬质胺制备载MicroRNA阳离子脂质体中RNA含量测定的方法。方法：采用Q5000微量紫外–可见分光光度计，检测波长为260 nm，进行标准曲线绘制，精密度，重复性，稳定性及回收率等考察，建立可靠的、灵敏的RNA含量测定方法。结果：得到MicroRNA的线性回归方程：Y = 1.0378X − 4.054 6，(R2 = 0.9984)，在3.32~1091.22 ng/μL范围内具有良好的线性关系，精密度RSD值为0.41%，重复性RSD值为3.62%，稳定性RSD值为0.63%，加样回收率平均值为99.80%，RSD值为1.81%。阳离子脂质体中MicroRNA含量为200.73 ± 10.31 ng/μL。结论：本实验方法简便准确、重复性好、灵敏度高、含量测定方法稳定可行，适用于阳离子脂质体中MicroRNA的含量测定。
Abstract: Objective: To establish a method for the determination of RNA in MicroRNA cationic liposomes prepared with Stearic amine. Methods: A Q5000 UV-visible spectrophotometer was used with the detection wavelength of 260 nm, and the standard curve drawing, precision, repeatability, stability and recovery were investigated to establish a reliable and sensitive method for the determination of RNA content. Results: The linear regression equation for MicroRNA was obtained: Y = 1.0378X − 4.0546, (R2 = 0.9984), with good linearity in the range of 3.32~1091.22 ng/μL, precision RSD value of 0.41%, repeatability RSD value of 3.62%, stability RSD value of 0.63%, mean spiked recovery of 99.80%, and the RSD value was 1.81%. The content of MicroRNA in cationic liposomes was 200.73 ± 10.31 ng/μL. Conclusion: The established present experimental method was simple, accurate, reproducible, sensitive, stable and could be used for the determination of MicroRNA in cationic liposomes.
文章引用：贺井刚, 吴孟岚, 文鑫鑫, 谭霖, 杨从武. 微量紫外–可见分光光度法测定阳离子脂质体中MicroRNA的含量[J]. 药物化学, 2025, 13(2): 168-175. https://doi.org/10.12677/hjmce.2025.132018

1. 引言

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20~24个核苷酸的小RNA，是短的非编码RNA调控元件，其在细胞内具有多种重要的调节作用[1]。以RNA为技术原理在医疗领域进行治疗病症事业已然有了一定的初步发展，到目前为止，已有Patisiran，Givlaari，Oxlumo，Leqvio和Amvuttra等五种RNA药物递送系统获得美国食品和药物管理局批准并上市[2]。脂质体介导的基因传递是最早的用于把外源性遗传物质引入宿主细胞的策略之一[3] [4]。在20世纪80年代，有研究证明使用脂质体可以向宿主细胞传递外源性的球蛋白信使RNA (Globin mRNA)、DNA和染色体[5]。脂质体是一种以脂质为基础的囊泡系统，最常使用的阳离子脂质体是两亲性分子，其共有结构由一个带正电荷的头基和一个或两个由烃链或甾类结构组成的疏水尾部区域组成[6] [7]，且具备较好的安全性和生物降解性。

结合国内外研究，现有的RNA含量测定方法有如下几种：普通紫外–可见分光光光度法[8] [9]、凝胶电泳法、荧光分光光度法、高效液相色谱法[10] [11]。普通紫外–可见分光光度法在药物分析[12]、标准物质研制[13]等领域都发挥着重要的作用。普通紫外–可见分光光度计利用核酸分子在260 nm处具有最大吸收峰，可进行定量分析[14]。但是普通紫外–可见分光光度法用于核酸标准物质特性量值确定时，只适用于浓度高，纯度大的RNA样品[8]。

凝胶电泳法进行RNA电泳是常用的分子生物学实验技术，可分为非变性电泳和变性电泳[15]。目前，最常用的变性电泳为甲醛琼脂糖凝胶电泳[16]。琼脂糖凝胶机械强度较差，容易破碎，保存不方便，配置的时间需要临近使用的时间，RNA浓度过低时条带不明显；最终测得的结果定量精确性差[17]。荧光分光光度法在近年来在RAN含量测定领域被应用。但是，用于RNA定量研究的荧光染料其自身有较高的本底荧光，对于<50 bp基因片段灵敏度较低，也并不适合21 bp的siRNA含量测定等研究[18] [19]。同时，在荧光的光强并不高时，呈线性情况并不是很理想；受某些离子的干扰影响，荧光会湮灭，实验速度必须要快[20] [21]。因此，开发同时具备操作简便、灵敏度高、样品量小的核酸类药物含量测定方法具有较大的必要性。

Quawell Q5000是一款微容量的紫外可见分光光度计。在全光谱(200~850 nm)范围内可以测量核酸、微阵列探针、纯化后的蛋白质和荧光染色蛋白；监测悬浮的细胞、细菌和酵母培养物的密度；同时也可以进行一般的实验室紫外–可见光吸光度测量。Q5000不需要使用比色皿，上样量仅需0.5~2 ul，并在大约8秒内测量出样品浓度，具有高度的准确性和可重复性。

本课题采用前期实验研究制备的负载MicroRNA的硬脂胺阳离子脂质体(Stearic amine cationic liposome/MicroRNA, SCL/MicroRNA)，使用Q5000微量紫外–可见分光光度计对RNA含量测定方法的建立，拟对RNA含量测定方法进行补充，为RNA药物递送系统的发展提供实验参考。

2. 材料与方法

2.1. 仪器

Q5000微量紫外可见分光光度计(上海在途生物科技有限公司)；KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；IKA RV3旋转蒸发仪(艾卡仪器设备有限公司)；UPW型实验室专用纯水仪(成都天莘宁科技有限公司)；Avanti脂质体挤出器(美国Avanti Polar Lipids公司)。

2.2. 试药与试剂

MicroRNA (上海吉玛制药技术有限公司，批号：20240522，20240726，20240810)；甲醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号：20241127)；DEPC去酶水(北京solarbio公司，批号：20241007)；MicroRNA阳离子脂质体自制(批号：20240220，20240221，20240224)；大豆磷脂(PC，上海太伟药业有限公司，批号202408012，纯度90%)；胆固醇(CHO，上海源叶生物，批号57885，纯度95%)；硬脂胺(上海源叶生物，批号F2001126，纯度97%)。

2.3. 方法

2.3.1. 载MicroRNA硬脂胺阳离子脂质体(SCL/MicroRNA)的制备

精密称取120 mg PC、40 mg CHO、5 mg硬脂胺溶于5 mL无水乙醇，50℃超声溶解，于50℃水浴旋蒸除去有机溶剂，加入12 mL DEPC去酶水于50℃水浴超声水合30 min，于挤出器过孔径为200 nm的聚碳酸酯膜7次，得阳离子脂质体SCL。选择N:P为10:1作为其最佳复合氮磷比将SCL和MicroRNA在室温下孵育30 min，得SCL/MicroRNA。

2.3.2. 测定方法

1. 测定波长的选择

RNA在260 nm吸收最强，参照(中国药典2020版通则0401)，在260 nm处吸收峰的比吸光系数E1%1 cm值(207)为计算含量依据。

2. 对照品溶液的制备

取购买的MicroRNA，按照说明书配置成溶液，加入DEPC去酶水31 μL使其溶解并摇匀，即得浓度为1064.00 ng/μL的MicroRNA储备液。

3. 供试品溶液及空白对照溶液的制备

分别精密量取实验室前期制备的SCL/MicroRNA和10% Triton X-100 (v/v) 10.0 μL，40 KHz超声5 min破乳，混匀，即得SCL/MicroRNA供试品溶液；精密量取实验室自制SCL，同法操作，即得空白对照溶液。

4. 样品测定

打开仪器，设置测量对象为RNA，波长设置为260 nm，移液枪精密吸取2.0 μL空白溶液调零，擦拭纸搽干空白溶液，移液枪精密吸取2.0 μL供试品溶液测量即得RNA的浓度。

2.4. 方法学考察

2.4.1. 线性关系

精密量取对照品的储备液，用DEPC去酶水分别配置成4.16、16.63、66.50、133.00、266.00、532.00、1064.00 ng/μL的样品。用微量紫外–可见分光光度计在260 nm波长处测定浓度，以理论浓度为横坐标，实际浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.4.2. 精密度考察

取MicroRNA对照品溶液20 μL，将溶液摇匀，平行制备6份，连续6次测定RNA浓度，记录测定结果并计算RSD。

2.4.3. 重复性试验

取制备好的SCL/MicroRNA样品6份，按照“2.3.2.3”法制备供试品溶液，按“2.3.3.4”测定浓度，记录测定结果并计算RSD。

2.4.4. 溶液稳定性试验

1. 对照品冻融稳定性

取“2.3.2.2”的对照品溶液，于−20℃反复冻融1、2、3、4、5、6次后测定RNA浓度，记录测定结果并计算RSD。

2. 供试品储存稳定性

取“2.3.2.3”供试品溶液，分别室温下储存0、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h后按“2.3.3.4”测定浓度，记录测定结果并计算RSD。

2.4.5. 加样回收试验

分别精密量取6份MicroRNA含量为219.36 ng的SCL/MicroRNA样品2 μL，置1.5 mL EP管中，并精密量取MicroRNA对照品溶液2 μL(每2 μL中miR-126含量为532.00 ng)加样，按“2.3.2.3”供试品溶液的制备方法制备加样回收样品溶液，按“2.3.3.4”测定浓度，计算回收率。

2.4.6. 含量测定

分别取3批MicroRNA阳离子脂质体制剂样品，按“2.3.2.3”项下供试品溶液的制备方法制备，按“2.3.3.4”测定浓度，并计算阳离子脂质体中MicroRNA含量。

3. 结果

3.1. MicroRNA线性考察结果

用微量紫外–可见分光光度计在260 nm波长处测定浓度，以理论浓度为横坐标，实际浓度为纵坐标，绘制标准曲线。拟合得MicroRNA的线性回归方程为(n = 7) Y = 1.0378X − 4.0546，(R2 = 0.9984)，在3.32~1091.22 ng/μL范围内线性关系良好，标准曲线见图1。

3.2. 精密度考察

MicroRNA对照品溶液连续检测6次，计算得精密度RSD为0.41%，表明仪器精密度良好。考察结果见表1。

3.3. 重复性试验

重复性试验测得RSD值为3.62%，结果表明重复性良好。考察结果见表2。

Figure 1. MicroRNA linear experimental results

图1. MicroRNA线性实验结果

Table 1. Precision test results

表1. 精密度试验结果

编号

浓度(ng/μL)

平均浓度(ng/μL)

RSD

1

281.13

282.75

0.41%

2

283.34

3

282.33

4

282.60

5

284.61

6

282.50

Table 2. Repeatability test results

表2. 重复性试验结果

编号

浓度(ng/μL)

平均浓度(ng/μL)

RSD

1

176.39

188.30

3.62%

2

185.08

3

195.78

4

190.16

5

189.75

6

192.65

3.4. 稳定性试验

稳定性考察对照品溶液测量得到RSD为0.63%，供试品溶液RSD为2.75%；表明对照品在−20℃条件下保存，反复冻融6次基本稳定，供试品溶液在室温条件下，至少48 h内基本稳定。对照品稳定性见表3，供试品稳定性结果见表4。

Table 3. Stability test results of reference substance

表3. 对照品稳定性试验结果

冻融次数(次)

浓度(ng/μL)

平均浓度(ng/μL)

RSD

1

282.60

282.48

0.63%

2

282.18

3

282.93

4

284.15

5

283.82

6

279.19

Table 4. Test results of stability of test sample

表4. 供试品稳定性试验结果

储存时间(h)

浓度(ng/μL)

平均浓度(ng/μL)

RSD

0

199.27

206.17

2.75%

0.25

198.91

0.5

201.59

1

202.36

2

205.26

4

207.67

6

208.87

12

209.14

24

213.47

48

215.19

3.5. 加样回收率试验

按公式：回收率 = (加标试样测定值 − 试样测定值)/加标量 × 100%，平均回收率为99.80%，RSD值为1.81 %，该含量测定方法加样回收率平均值为99.80%。结果见表5。

Table 5. Experimental results of sample recovery rate

表5. 加样回收率实验结果

序号

取样量/μL

样中量/ng

加入量/ng

测得量/ng

回收率/%

平均值

RSD%

1

2.00

219.36

564.66

763.08

96.29

782.90

1.81%

2

2.00

219.36

564.66

798.76

102.61

3

2.00

219.36

564.66

796.00

102.12

4

2.00

219.36

564.66

793.86

101.74

5

2.00

219.36

564.66

760.28

95.80

6

2.00

219.36

564.66

785.38

100.24

3.6. 含量测定

三批阳离子脂质体中MicroRNA平均含量分别为211.43 ng/μL，190.85 ng/μL，199.92 ng/μL。RSD值分别为2.6%，0.82%，0.73%，表明该阳离子脂质体中的MicroRNA含量较稳定。结果见表6。

Table 6. Experimental results of content determination (n = 3)

表6. 含量测定实验结果(n = 3)

样品

批号

含量(ng/μL)

RSD

1

20240220

211.43

2.6%

2

20240221

190.85

0.82%

3

20240224

199.92

0.73%

4. 讨论

目前，RNA含量测定方法主要有普通紫外–可见分光光度法、凝胶电泳法、荧光分光光度法等；但均存在精密度不高，灵敏度较差，操作过程繁琐，用量大等一种或多种同时存在的缺点。本课题使用微量紫外–分光光度计测量MicroRNA的含量，设定好检测对象和最大吸收波长后可直接测量得到RNA的浓度；操作简便、检测范围较广。

在实验过程中，由于MicroRNA是核酸的一种，而核酸又存在易被酶解或聚集等缺点，因此在测量时需使用无酶枪头，以防止MicroRNA被酶解，每次测量前需吹打样品数次保证测量结果的准确性。SCL阳离子脂质体由PC、CHO和硬脂胺按一定比例制备，辅料在260 nm处会出现一定吸收，从而干扰最终测得MicroRNA的浓度，因此在测定MicroRNA供试品浓度时务必使用空白SCL溶液调零。同样，在对供试品进行稳定性实验时，温度和时间都会对其结果造成影响，在4℃条件下存放测得结果不稳定，RSD值较大，可能是由于阳离子脂质体在4℃条件下可能发生相变，导致脂质双分子层排列紊乱(如从液晶相转变为凝胶相)。这种相变会破坏脂质体与microRNA的静电复合结构，使包封的核酸释放。研究显示，DOTAP/DOPE脂质体在低于相变温度(Tm)时粒径会增大20%~40%。在室温下只能保证存放48 h内RSD值在规定范围内，若室温放置时间增加，则RSD值会随着时间的增加而增大。因此，考虑将脂质体制备成冻干粉针剂，可能是实验室自制的MicroRNA阳离子脂质体稳定性改进的一个理想方法。

通过方法学研究与验证，本文建立的以MicroRNA为模型测定RNA含量的微量紫外–分光光度法线性、精密度、加标回收率等均良好，可以对RNA含量测定方法进行补充，为RNA药物递送系统发展提供实验参考。随着核酸药物(如mRNA疫苗、siRNA、ASO等)的快速发展，准确、高效、稳定的含量测定技术成为质量控制的关键环节；未来核酸药物含量测定技术的发展将围绕高灵敏度、自动化、智能化、无损化方向发展，并结合微流控、CRISPR检测、AI分析等前沿技术。

参考文献

[1] Jiménez-Morales, J.M., Hernández-Cuenca, Y.E., Reyes-Abrahantes, A., Ruiz-García, H., Barajas-Olmos, F., García-Ortiz, H., et al. (2022) MicroRNA Delivery Systems in Glioma Therapy and Perspectives: A Systematic Review. Journal of Controlled Release, 349, 712-730.
https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2022.07.027
[2] Paul, A., Muralidharan, A., Biswas, A., Kamath, B.V., Joseph, A. and Alex, A.T. (2022) siRNA Therapeutics and Its Challenges: Recent Advances in Effective Delivery for Cancer Therapy. OpenNano, 7, Article ID: 100063.
https://doi.org/10.1016/j.onano.2022.100063
[3] Cai, W., Liu, J., Zheng, L., Xu, Z., Chen, J., Zhong, J., et al. (2021) Study on the Anti-Infection Ability of Vancomycin Cationic Liposome Combined with Polylactide Fracture Internal Fixator. International Journal of Biological Macromolecules, 167, 834-844.
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020.11.039
[4] Yang, S., Tang, Q., Chen, L., Chang, J., Jiang, T., Zhao, J., et al. (2020) Cationic Lipid‐Based Intracellular Delivery of Bacterial Effectors for Rewiring Malignant Cell Signaling. Angewandte Chemie International Edition, 59, 18087-18094.
https://doi.org/10.1002/anie.202009572
[5] Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L.K. and Farokhzad, O.C. (2008) Factors Affecting the Clearance and Biodistribution of Polymeric Nanoparticles. Molecular Pharmaceutics, 5, 505-515.
https://doi.org/10.1021/mp800051m
[6] Yadav, K., Singh, D., Singh, M.R. and Pradhan, M. (2020) Multifaceted Targeting of Cationic Liposomes via Co-Delivery of Anti-Il-17 siRNA and Corticosteroid for Topical Treatment of Psoriasis. Medical Hypotheses, 145, Article ID: 110322.
https://doi.org/10.1016/j.mehy.2020.110322
[7] Fotoran, W.L., Kleiber, N., Glitz, C. and Wunderlich, G. (2020) A DNA Vaccine Encoding Plasmodium falciparum PfRH5 in Cationic Liposomes for Dermal Tattooing Immunization. Vaccines, 8, Article 619.
https://doi.org/10.3390/vaccines8040619
[8] 徐明明, 郑璐侠, 王自强, 等. 注射用核糖核酸的含量测定方法比较[J]. 中国医药工业杂志, 2016, 47(11): 1436-1441.
[9] Jia, X., Liu, Y., Wagner, A.M., Chen, M., Zhao, Y., Smith, K.J., et al. (2021) Enabling Online Determination of the Size-Dependent RNA Content of Lipid Nanoparticle-Based RNA Formulations. Journal of Chromatography B, 1186, Article ID: 123015.
https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2021.123015
[10] 张再平, 吴小曼, 石蓓佳, 等. 反相离子对色谱法测定注射用核糖核酸酶解产物中的5’-核苷酸[J]. 中南药学, 2013, 11(3): 194-198.
[11] Hua, J. and Huang, K.L. (2010) Optimization by Orthogonal Array Design of Ion-Pair HPLC Separation of the Enzymatic Hydrolysis Products of Yeast RNA. Chinese Chemical Letters, 21, 1453-1456.
https://doi.org/10.1016/j.cclet.2010.07.002
[12] 郑冬妮. 紫外-可见分光光度计测定食品中亚硝酸盐含量的不确定度评定[J]. 食品界, 2017(3): 88-89.
[13] Yao, D.B., Chi, D.F., Yu, J., et al. (2009) An Improved Method for Extraction of Nucleic acid from Coleopteran Insects. Journal of Northeast Forestry University, 37, 86-88. (In Chinese)
[14] 陈怡, 张辉, 邓超. 醋酸氢化可的松纯度标准物质的定值及不确定度分析[J]. 化学试剂, 2018, 40(3): 261-268.
[15] Mergny, J. (2005) Thermal Difference Spectra: A Specific Signature for Nucleic Acid Structures. Nucleic Acids Research, 33, e138.
https://doi.org/10.1093/nar/gni134
[16] Bryant, S. and Manning, D.L. (1998) Formaldehyde Gel Electrophoresis of Total RNA. In: Rapley, R. and Manning, D.L., Eds., RNA Isolation and Characterization Protocols, Humana Press, 69-72.
https://doi.org/10.1385/0-89603-494-1:69
[17] Farrell, R.E. (2017) Electrophoresis of RNA. In: Farrell Jr., R.E., Ed., RNA Methodologies, Elsevier, 383-426.
https://doi.org/10.1016/b978-0-12-804678-4.00013-0
[18] Sharma, S., Mazumdar, S., Italiya, K.S., Date, T., Mahato, R.I., Mittal, A., et al. (2018) Cholesterol and Morpholine Grafted Cationic Amphiphilic Copolymers for Mirna-34a Delivery. Molecular Pharmaceutics, 15, 2391-2402.
https://doi.org/10.1021/acs.molpharmaceut.8b00228
[19] 孟月, 王丹, 王雪蕾, 郭晓茹, 夏桂民. 建立共载米铂与核酸miR-34a阳离子脂质体中miR-34a的含量测定方法[J]. 中国医药生物技术, 2020, 15(3): 235-239.
[20] Liu, X., Xu, G.M., Guo, J.F., et al. (2008) A Method for Quantification of Double Strand DNA Using SYBR Green I Dye. China Biotechnology, 28, 55-60.
[21] 沈雁, 涂家生, 庞卉, 朱家壁. 凝胶电泳法及荧光光度法测定siRNA阳离子脂质体的含量和包封率[J]. 药学学报, 2009, 44(4): 430-435.