酵母细胞诱导自溶对葡萄酒泥溶出物抑制酪氨酸酶作用的影响

The Impact of Yeast Cell Induced Autolysis on the Inhibition of Tyrosinase by Wine Lees Solubles

摘要: 本试验以葡萄酒泥为原料，测定诱导自溶对山葡萄酒泥溶出物抑制酪氨酸酶作用的影响，通过单因素试验考察了固体含量、pH值、NaCl浓度、培养温度、培养时间对抑制率的影响，在单因素基础上，通过正交试验确定了诱导自溶处理葡萄酒泥的最佳条件。结果为：固体含量为15% (w/v)、pH值为5、NaCl浓度为3% (w/v)、培养温度为35℃、培养时间8 h，在此条件下，酒泥溶出物对酪氨酸酶的抑制率最大，效果最好。

Abstract: In this experiment, wine lees were used as raw materials to determine the effect of induced autolysis on the inhibition of tyrosinase by Vitis amurensis wine lees extracts. The effects of solid content, pH value, NaCl concentration, culture temperature and culture time on the inhibition rate were investigated through single factor experiments. On the basis of single factors, the optimal conditions for induced autolysis treatment of wine lees were determined through orthogonal experiments. The results showed that the solid content was 15% (w/v), pH value was 5, NaCl concentration was 3% (w/v), culture temperature was 35˚C, and culture time was 8 h. Under these conditions, the inhibition rate of wine lees extract on tyrosinase was the highest and the effect was the best.

1. 引言

葡萄是世界上产量最大的水果之一，年产量约为6500万t，其中80%用于酿酒、13%作为鲜果食用、7%用于加工果汁及其它葡萄产品[1]。近年来葡萄酒泥在葡萄酒酿造中应用越来越广泛[2]。葡萄酒酿造过程中会产生大量的废弃物，如葡萄梗、葡萄皮渣、酒泥等，占葡萄酒产量的20%~30% [3]。葡萄酒泥是葡萄酒发酵结束后、贮藏期间以及过滤或者离心后得到的沉淀物和残渣，占葡萄酒产量的2%~6% [4]。葡萄酒泥是葡萄酒酿造过程中产生的主要副产物之一，据统计加工一万吨葡萄酒，产生的酒泥约在600吨以上，含有果胶、蛋白质、多酚等物质[5]。从植物组织中提取得到的果胶已作为凝胶剂、增稠剂、稳定剂等被广泛应用于食品、化妆品行业[6]。且葡萄酒泥是一种主要由酵母细胞及其代谢物组成的泥膏状物质，富含多酚和酵母多糖，具有一定的抗氧化能力，当其作用于表皮时，有助于修复皮肤表层胶原蛋白，抑制黑色素形成，有美白、抗衰老以及其他美容功能[7]。与其他食品废弃物相比，酒泥拥有非常丰富的活性成分，因此它作为高附加值产品的开发值得深入研究[8]。

自溶是发生在生物体消亡阶段的一种内在的反应和现象，在无外来干预的情况下可自发发生，大多数微生物为单细胞生物，微生物的自溶一般为其细胞受到环境的胁迫或者细胞衰老死亡而使得细胞自身溶酶体释放水解酶到细胞质中，导致细胞质内的物质被水解留下空壳或者裂解的一种自然降解过程[9]。根据发生方式则可分为诱导自溶(Induced autolysis)和自然自溶(Natural autolysis) [10]。近年来，诱导自溶的手段不断被开发利用，比如添加无机盐等化学物质、酸解、添加外源酶和高压均质等[11]。

本研究采用诱导自溶法促进酒泥酵母细胞的解体，释放细胞内的活性成分，为酒泥在化妆品开发中的应用提供参考。

2. 材料与方法

2.1. 材料与仪器

葡萄酒泥：源自公酿28号葡萄酒沉淀物；酪氨酸酶(500 u/mg)：上海士锋生物科技有限公司；酪氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、盐酸、氢氧化钠、氯化钠等试剂均为国产分析纯。

电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；电热恒温水浴锅(上海高质精密仪器有限公司)；TGL-16M离心机(长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；722N分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司制造)；PHS-3G pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

2.2. 试验方法

2.2.1. 操作步骤

葡萄酒泥→预处理→离心分离→调节固体含量→调节pH值→加入缓冲液→诱导自溶→离心分离→上清液→加入缓冲液→水浴锅恒温→测定吸光度。

2.2.2. 操作要点

1) 葡萄酒泥预处理

酒泥与蒸馏水1:1混合，通过80筛过滤网过滤，离心机3000 r/min离心5 min，取沉淀(酒泥)备用。

2) 诱导自溶处理

取适量酒泥与水混合，配制成固体含量为15% (w/v)的悬浮液，用1:1 HCl将pH调至5，加入NaCl，使NaCl浓度为3% (w/v)，在35℃条件下搅拌培养8 h，之后，3000 r/min离心5 min，取上清液按1.4方法测酪氨酸酶抑制率。

2.3. 试验设计

2.3.1. 单因素试验设计

取适量酒泥与水混合，配制成固体含量分别为5% (w/v)、10% (w/v)、15% (w/v)、20% (w/v)、25% (w/v)的悬浮液，pH值分别调整至3、4、5、6、7，加入NaCl，使NaCl浓度分别为1% (w/v)、2% (w/v)、3% (w/v)、4% (w/v)、5% (w/v)，分别在5℃、45℃、55℃、65℃、75℃条件下搅拌培养8 h、16 h、24 h、32 h、40 h。

2.3.2. 正交试验

根据单因素试验结果选择NaCl浓度、pH、固体含量、培养温度四个因素进行正交试验，设计L₉^{(3^4)}四因素三水平正交试验(如表1)，选出抑制率最高时诱导自溶条件。

Table 1. Factors and levels of orthogonal experiment

表1. 正交试验因素水平表

水平	因素
	NaCl (w/v) A	pH B	固体含量(w/v) C	培养温度(℃) D
1	2	4	10	35
2	3	5	15	55
3	4	6	20	75

2.4. 酪氨酸酶抑制率测定[12] [13]

分别配制pH 6.8的PBS(磷酸盐缓冲液)、1.0 mg/mL的L-酪氨酸溶液和70 μg/mL的酪氨酸酶溶液。按照以下配比加样。

测试样1：4.0 mL PBS + 1.0 mL酪氨酸酶溶液 + 1.0 mLL-酪氨酸溶液；

测试样2：5.0 mL PBS + 1.0 mL酪氨酸溶液；

测试样3：1 mL诱导自溶离心上清液 + 3.0 mL PBS + 1.0 mL酪氨酸酶溶液 + 1.0 mLL-酪氨酸溶液；

测试样4：1 mL诱导自溶离心上清液 + 4.0 mL PBS + 1.0 mL酪氨酸溶液。

将各测试样混匀后，置37℃水浴中30 min，在475 nm处测吸光度(A₁~A₄)。

按下式计算酪氨酸酶抑制率：

$\text{I}=\left[1-\left({\text{A}}_3-{\text{A}}_4\right)/\left({\text{A}}_1-{\text{A}}_2\right)\right]\times 100\%$

3. 结果与分析

3.1. 单因素试验结果与分析

3.1.1. 固体含量对酪氨酸酶抑制率的影响

由图1可知，当固体含量由5%上升至15%时，酪氨酸酶抑制率随着固体含量的上升而逐渐增大。在固体含量达到15%时，抑制率达到最大值。当固体含量由15%增加至25%时，酪氨酸酶抑制率随固体含量的增加而下降。说明酒泥溶出物对酪氨酸酶的抑制率并不会随着固体含量的增加而上升。

Figure 1. The effect of solid content on inhibition rate

图1. 固体含量对抑制率的影响

3.1.2. pH值对酪氨酸酶抑制率的影响

由图2可知，当pH值由3上升到5时，酪氨酸酶抑制率随着pH值的上升而逐渐增大。在pH值达到5时，抑制率达到最大值。当pH值由5上升至7时，酪氨酸酶抑制率有所下降。其原因可能是当pH值为5时，达到了酒泥中酵母细胞内自溶酶的适宜pH值，自溶酶充分水解底物，产生大量能够抑制酪氨酸酶的活性物质，而当pH偏离5时，自溶酶活性均降低，影响自溶效果[12]。

3.1.3. NaCl浓度对酪氨酸酶抑制率的影响

由图3可知，当诱导自溶NaCl浓度由1%上升至2%时，酪氨酸酶抑制率随着NaCl浓度的上升而减小。当诱导自溶NaCl浓度由2%上升至3%时，酪氨酸酶抑制率随着NaCl浓度的上升而增大，抑制率达到最大值。当诱导自溶NaCl浓度由3%上升至5%时，酪氨酸酶抑制率随着NaCl浓度的上升而逐渐减小。这主要是由于NaCl有利于酵母细胞的质壁分离，从而促进酵母细胞内的自溶酶与底物的充分接触[12]。当NaCl添加量小于3%时，适量的盐浓度能够较明显地促进酶促反应，而当NaCl添加量大于3%时，较大的盐浓度会抑制自溶酶的活性。

Figure 2. The effect of pH value on inhibition rate

图2. pH值对抑制率的影响

Figure 3. The effect of NaCl concentration on inhibition rate

图3. NaCl浓度对抑制率的影响

3.1.4. 培养温度对酪氨酸酶抑制率的影响

由图4可知，当培养温度由35℃上升至55℃时，酪氨酸酶抑制率随着培养温度的上升而逐渐增大。在固体含量达到55℃时，抑制率达到最大值。当培养温度从55℃上升至75℃时，酪氨酸酶抑制率随着培养温度的升高而下降。当培养温度在35℃~55℃范围时，随着温度的升高，酒泥酵母细胞内的自溶酶的活性也逐渐上升，酶促反应速度加快，活性物质产量也逐渐提高，使酒泥溶出物的酪氨酸酶抑制率也随之增加。当温度超过55℃时，较高的温度抑制了自溶酶的活性，导致酒泥溶出物的酪氨酸酶抑制率下降。

3.1.5. 培养时间对酪氨酸酶抑制率的影响

由图5可知，当诱导自溶培养时间为8 h，16 h，24 h时，酪氨酸酶抑制率值接近，抑制效果没有显著差异。当培养时间从24 h增加到40 h时，酪氨酸酶抑制率显著下降。说明诱导自溶时间不易过长，使溶出物发生变化，降低抑制率。

Figure 4. The effect of culture temperature on inhibition rat

图4. 培养温度对抑制率的影响

Figure 5. The effect of culture time on inhibition rate

图5. 培养时间对抑制率的影响

3.2. 正交试验结果与分析

通过单因素试验结果可知，由于培养时间在24 h内对抑制率的影响不显著，因此选择NaCl浓度(A)、pH值(B)、固体含量(C)、培养温度(D)进行L₉^{(3^4)}四因素三水平正交试验，结果如表2所示。

Table 2. Results of orthogonal experiment

表2. 正交试验结果

试验号	NaCl浓度(w/v) (A)	pH值 (B)	固体含量(w/v) (C)	培养温度(℃) (D)	抑制率 (%)
1	2	2	3	1	71.3
2	1	1	1	1	38.1
3	2	1	2	3	58.6
4	2	3	1	2	54
5	3	1	3	2	33.2
6	3	2	1	3	14.9
7	3	3	2	1	59.8
8	1	2	2	2	71.3
9	1	3	3	3	14.9
k1	41.43	43.30	35.67	56.40
k3	61.30	52.50	63.23	52.83
k4	35.97	42.90	39.80	29.47
R	25.33	9.60	27.56	26.93	C > D > A > B

由表2可知，各因素影响效果大小为C > D > A > B，即固体含量 > 培养温度 > NaCl浓度 > pH值。其中效果最好的组合是A₂B₂C₂D₁，即在NaCl浓度为3% (w/v)、pH值为5、固体含量为15% (w/v)、培养温度为35℃时，诱导自溶对酪氨酸酶抑制率的影响效果最好。由于最佳组合在正交试验中并未出现，故与正交试验结果表里抑制率最高的两组A₂B₂C₃D₁、A₁B₂C₂D₂做验证试验。结果如表3。

验证试验A₂B₂C₂D₁即在NaCl浓度为3% (w/v)、pH值为5、固体含量为15% (w/v)、培养温度为35℃时，抑制率为81.6%。比正交试验最优组合抑制效果好，故验证试验为最佳抑制效果组合。

Table 3. Validation test results of table 2 orthogonal experiment results

表3. 验证试验结果表2正交试验结果

试验号	组合	抑制率(%)
1	A2B2C3D1	71.3
2	A1B2C2D2	71.3
3	A2B2C2D1	81.6

4. 结论

以酪氨酸酶抑制率为指标，采用单因素试验和正交试验，确定了诱导自溶法处理葡萄酒泥的最佳条件为：NaCl浓度为3% (w/v)、pH值为5、固体含量为15% (w/v)、培养温度为35℃，培养时间8 h，在此条件下，酒泥溶出物对酪氨酸酶的抑制率最大，效果最好。

基金项目

通化师范学院2024年大学生创新创业训练计划(202410202015)。

NOTES

^*通讯作者。