1. 引言
黄精又名仙人余粮、野生姜、鸡头参等，最早记载于《名医别录》，历代本草典籍中都对其有详细的形态描述[1]。泰山黄精最早详细记载于名医高宗岳的《泰山药物志》中，与泰山何首乌、泰山参、泰山紫草被誉为“泰山四大名药”，且居于首位[1] [2]。黄精药理作用广、生物学活性多，其成分中黄精多糖含量较高，与之相关的研究也多[3]。
还原糖的含量测定方法有色谱法、滴定法、比色法等。比色法常用的有蒽酮–硫酸法、苯酚–硫酸法、DNS法，其中DNS法也被用于水果及制品、中草药等还原糖、总糖或多糖的含量测定，该方法的原理为在碱性条件下，还原糖将3,5-二硝基水杨酸的硝基还原成氨基生成橘红色化合物，在一定范围内，还原糖与颜色成正比[4] [5]，用于黄精多糖的含量测定具有可行性。《中国药典》(2020年版)一部中收载的黄精多糖的测定方法为蒽酮–硫酸法[6]，也有文献采用苯酚–硫酸法[7] [8]，这两种方法都会用到腐蚀性较强的硫酸，存在安全隐患、环境污染。本研究在查阅文献的基础上，对DNS法测定黄精多糖含量的检测波长和条件进行考察，建立测定黄精多糖含量的方法，实现在无硫酸条件下测定黄精多糖含量，并用该方法测定泰山生黄精及九蒸九制各炮制品黄精多糖含量。
2. 材料
2.1. 仪器
GZX-9140MBE型电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)；SMF01型磨粉机(浙江苏泊尔股份有限公司)；ME104型电子天平(METTLER TOLEDO)；HH-4型数显恒温水浴锅(金坛市友联仪器研究所)；RE-2000A型旋转蒸发仪(巩义市瑞力仪器设备有限公司)；2型涡旋仪(Scientific Industries)；Varioskan LUX多功能微孔板酶标仪(ThermoFisher Scientific)。
2.2. 药品与试剂
鲜黄精(泰安市泰山四大名药开发有限公司)；D(+)-无水葡萄糖(批号：2230816004，标准品，北京索宝来科技有限公司)；氢氧化钠(批号：20200224，分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；盐酸(批号：20210207，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(批号：20240102)、3,5-二硝基水杨酸(批号：20230312)、苯酚(批号：20230412)、无水亚硫酸钠(批号：20230803)、酒石酸钾钠(批号：20230412)、甲基红(批号：20231008)均为分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司。
3. 方法
3.1. 溶液配制
DNS试剂：称量酒石酸钾钠92.5 g放入1000 mL烧杯中，加入250 mL热纯化水溶解，称量DNS 3.15 g、量取2 mol/L氢氧化钠溶液131 mL加入到酒石酸钾钠溶液中，再加入苯酚2.5 g和亚硫酸钠2.5 g搅拌溶解，冷却，用纯化水定容至500 mL棕色容量瓶中备用[9]。
D(+)-无水葡萄糖标准溶液：精密称取D(+)-无水葡萄糖标准品0.0165 g置25 mL容量瓶中，加纯化水溶解，定容，摇匀后备用。
3.2. 生、熟黄精炮制品制备
生黄精：去除鲜黄精须根，洗净泥沙，切段后放入55℃干燥箱中干燥12 h。
熟黄精：去除鲜黄精须根，洗净泥沙，切段后放入蒸锅，隔水蒸制6 h，取出沥水后放入55℃干燥箱中干燥12 h得“一蒸一制”熟黄精。留样后重复操作得到蒸制2到9次的熟黄精[10]。
3.3. 黄精多糖溶液制备
按照《中国药典》(2020年版)一部中收载的黄精含量测定项下提取方法提取黄精多糖[6]，浓缩定容至25 mL容量瓶即得黄精多糖溶液。
3.4. 检测波长确定
DNS法测定还原糖含量时波长的选择差异很大，但范围在400~700 nm [9] [11]-[13]。考虑到紫外可见分光光度法波长误差及DNS试剂的影响，本研究对DNS法测定黄精多糖的最佳波长进行筛选，在400~700 nm波长范围内对纯化水 + DNS试剂、D(+)-无水葡萄糖标准品溶液 + DNS试剂、黄精多糖供试品溶液 + DNS试剂沸水浴显色后进行波普扫描，每隔1 nm记录吸光度值，绘制扫描曲线如图1。
Figure 1. Spectral scan of 400~700 nm band
图1. 400~700 nm波段光谱扫描图
由图1可知在400~480 nm范围内三条光谱曲线吸光度都很高基本重叠在一起；630~700 nm范围内吸光度很低，几乎接近于零；480~630 nm之间三条吸光度迅速下降且曲线不重合。当波长为540 nm时，纯化水 + DNS试剂的吸光度接近于零，说明水和DNS试剂对测定的干扰最小，故选择540 nm作为检测波长。
3.5. 检测条件考察
3.5.1. 水解时盐酸溶液用量
精密量取同一黄精多糖溶液2.0 mL 6份到10 mL具塞刻度试管中，分别精密加入盐酸溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，混匀后沸水浴中水解10 min，迅速冷却至室温后滴加3滴甲基红试剂，混匀后滴加氢氧化钠溶液中和至浅黄色，加纯化水稀释至10 mL，混匀后得黄精多糖供试品溶液。精密量取各供试品溶液2.0 mL，精密加入DNS试剂2.0 mL，摇匀后放入沸水浴中显色10 min，迅速冷却至室温后吸取显色溶液200 μL于540 nm波长处测定吸光度，绘制曲线如图2(a)。盐酸溶液用量在0.5至2.0 mL时吸光度逐渐增大，随着盐酸溶液用量的增加吸光度基本不变，因此，水解时盐酸溶液用量选择2.0 mL。
3.5.2. 水解时间
精密量取同一黄精多糖溶液2.0 mL 6份，精密加入盐酸溶液2.0 mL分别水解2.5，5.0，7.5，10，12.5，15 min，其他条件同“3.5.1”，显色后测定吸光度如图2(b)，水解时间在2.5~7.5 min时吸光度逐渐升高，7.5~15 min之间有波动但相差不大，10 min时吸光度最高，选择10 min作为盐酸水解时间。
3.5.3. 水解温度
精密量取同一黄精多糖溶液2.0 mL 6份，分别置50，60，70，80，90，100℃水浴水解10 min，其他条件同“3.5.1”，显色后测定吸光度如图2(c)，水解温度从50℃到90℃吸光度逐渐增大，90℃到100℃下降，因此水解温度设定为90℃。
3.5.4. DNS试剂用量
精密量取同一黄精多糖溶液2.0 mL 6份，分别精密加入DNS试剂0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0 mL，其他条件同“3.5.1”，显色后测定吸光度如图2(d)，DNS试剂添加0.5和1.0 mL时吸光度较高，添加1.0 mL时最高，随着添加量增大吸光度逐渐降低，DNS试剂用量选用1.0 mL。
3.5.5. 显色时间
精密量取同一黄精多糖溶液2.0 mL 6份，分别在沸水浴显色2.5，5，7.5，10，12.5，15 min，其他条件同“3.5.1”，显色后测定吸光度如图2(e)，显色时间在5 min之后吸光度趋于稳定，10 min和15 min时吸光度基本一致，从节能的角度考虑显色时间选择10 min。
3.5.6. 显色温度
精密量取同一黄精多糖溶液2.0 mL 6份，分别在50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃水浴显色10 min，其他条件同“3.5.1”，显色后测定吸光度如图2(f)。显色温度从50℃~80℃吸光度逐渐上升，80℃、90℃、100℃时吸光度差异较小，90℃稍高，故选择90℃作为显色温度。
Figure 2. Detection condition. (a) Dosage of hydrochloric acid solution during hydrolysis; (b) Hydrolysis time; (c) Hydrolysis temperature; (d) Dosage of DNS reagent; (e) Color development time; (f) Color development temperature
图2. 检测条件。(a) 水解时盐酸溶液用量；(b) 水解时间；(c) 水解温度；(d) DNS试剂用量；(e)显色时间；(f) 显色温度
3.6. 方法学考察
3.6.1. 标准曲线绘制
精密吸取D(+)-无水葡萄糖标准品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.2，2.0 mL，分别置10 mL试管中，加纯化水至2.0 mL，摇匀即得系列质量浓度溶液。以2.0 mL纯化水作空白溶液，各精密加入DNS试剂1.0 mL，摇匀，放入90℃水浴显色10 min，取出放入冰水浴冷却，静置至室温，分别吸取各溶液200 μL在540 nm处测定吸光度，以质量浓度(C, mg*mL−1)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线如图3，得回归方程A = 3.5902C − 0.1473，R2 = 0.9998 (n = 6)，表明D(+)-无水葡萄糖质量浓度在0.0608~0.6080 mg*mL−1范围内与吸光度线性关系良好。
Figure 3. D(+)-anhydrous glucose standard curve
图3. D(+)-无水葡萄糖标准曲线
3.6.2. 精密度
用吸取对照品溶液为0.6 mL的试管里的溶液，吸取6次，每次200 μL在540 nm处测定吸光度，求得D(+)-无水葡萄糖含量，计算RSD为0.74% (n = 6)，表明仪器精密度良好。
3.6.3. 加样回收率
精密量取已知浓度为1.15 mg*mL−1的黄精多糖溶液18.0 mL，加入精密称定的D(+)-无水葡萄糖23.8 mg，摇匀，精密量取溶液2.0 mL 6份，分别置10 mL具塞刻度试管中，按照确定的检测条件显色后测定吸光度，计算黄精多糖含量，回收率在98.09%~101.49%，RSD为1.28% (n = 6)。
3.6.4. 重复性
精密称定60℃干燥至恒重的泰山烘黄精细粉约0.25 g 6份，按照“3.3”的方法制备黄精多糖溶液，新建的检测方法测定吸光度，计算黄精多糖含量，结果黄精多糖的平均含量为26.94 mg，RSD为2.36% (n = 6)。
3.6.5. 溶液稳定性
随机选取重复性试验显色后的溶液，分别在0，10，20，40，60，80，100，120 min时吸取200 μL在540 nm处测定吸光度，计算黄精多糖含量，RSD为0.21% (n = 8)，结果表明溶液在2 h内稳定。
3.7. 多糖含量测定
精密移取生黄精及九蒸九制各炮制品多糖溶液2.0 mL，精密加入盐酸溶液2.0 mL混匀，90℃水浴水解10 min，迅速冷却至室温后滴加3滴甲基红试剂混匀，滴加氢氧化钠溶液中和至浅黄色，定容至10 mL混匀，精密移取各供试品溶液2.0 mL，以2.0 mL纯化水做空白，精密加入DNS试剂1.0 mL，摇匀后放入90℃水浴显色10 min，迅速冷却至室温后测定吸光度，计算黄精多糖含量，绘制曲线如图4。
Figure 4. Variation curve of polysaccharide content of Polygonatum from 0 to 9 times of steaming
图4. 0~9次蒸制黄精多糖含量变化曲线
4. 结论与讨论
泰山黄精生品到二蒸二制多糖含量迅速下降，二蒸二制到九蒸九制多糖含量变化不大。黄精多糖含量变化趋势与杨圣贤等[14]的研究基本一致。
《中国药典》(2020年版)一部中提取的黄精多糖溶液定容体积为250 mL，溶液浓度较低，由于DNS法需用盐酸溶液将黄精多糖溶液水解、氢氧化钠溶液中和，稀释至10 mL，所以对黄精多糖溶液进行了浓缩，定容体积为25 mL。检测波长范围是参考相关文献设定的，参考相关文献中的检测条件，对黄精多糖的每个检测条件设计并进行预实验，根据预实验结果对检测条件进行调整，确定了本研究的考察条件。
还原糖的含量测定方法中色谱法仪器设备昂贵、使用维护繁琐；滴定法检测结果易受滴定终点和人为因素影响。在3种比色法中，与苯酚–硫酸法、蒽酮–硫酸法相比较，DNS法使用的盐酸溶液腐蚀性低，不但能有效降低安全隐患、避免污染环境，而且仪器要求低、杂质干扰少，可用于黄精多糖含量快速批量测定[15]。
基金项目
山东省医药卫生科技项目(202313021398)，泰安市科技创新发展项目(2024NS342)。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。