红仁核桃内种皮提取物体外模拟消化的抗氧化活性研究

Antioxidant Activity of Inner Seed Coat Extract of Red Kernel Walnut Simulated Digestion in Vitro

摘要: 为研究红仁核桃内种皮消化后总酚、总黄酮活性物质在口腔、胃、小肠中的含量变化及抗氧化情况。通过对口腔、胃、小肠体外模拟对红仁核桃内种皮提取物进行消化，分别在胃、肠消化0 min、30 min、60 min、90 min、120 min后取样，测定红仁核桃内种皮在不同消化阶段总酚、总黄酮的变化以及在不同消化阶段的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力。研究表明：经口腔模拟消化后，红仁核桃内种皮总酚、总黄酮含量以及抗氧化活性与消化前相比略微下降；经胃模拟消化后，红仁核桃内种皮总酚、总黄酮含量以及抗氧化活性与消化前相比显著上升(P < 0.05)；而经过小肠模拟消化后，红仁核桃内种皮总酚、总黄酮含量以及抗氧化活性与消化前相比显著下降(P < 0.05)。

Abstract: This study aimed to investigate the changes in the contents of bioactive substances, namely total phenols and total flavonoids, derived from the digested inner seed coat of red kernel walnut, as well as their antioxidant properties, throughout the oral, gastric, and intestinal phases. By conducting in vitro simulated digestion of the inner seed coat extract of red walnut using oral, gastric, and intestinal models, samples were collected at 0 min, 30 min, 60 min, 90 min, and 120 min during gastric and intestinal digestion. The changes in total phenols and total flavonoids in the inner seed coat of red kernel walnut at different digestion stages, as well as its DPPH radical scavenging capacity and ABTS radical scavenging capacity at these stages, were then determined. The results showed that after oral simulated digestion, the content of total phenols, total flavonoids and antioxidant activity in the inner seed coat of red kernel walnut decreased slightly compared with that before digestion. After gastric simulated digestion, the contents of total phenols, total flavonoids and antioxidant activity in the inner seed coat of red kernel walnut increased significantly compared with those before digestion (P < 0.05). After simulated digestion in the small intestine, the contents of total phenols, total flavonoids and antioxidant activity in the inner seed coat of red kernel walnut decreased significantly compared with those before digestion (P < 0.05).

1. 引言

核桃内种皮，是包裹核桃种仁的一层种皮结构，其所含酚类物质的浓度远超核桃仁本身[1]。核桃内种皮含有丰富的维生素、矿物质、蛋白质和脂质等物质，营养价值较高，其薄膜结构有效地抑制了种仁的氧化降解，对果实生长及采后的品质维持至关重要，其中的多酚类物质主要是酚酸、可水解单宁，并含有许多脂质和少量的黄酮[2]-[4]。王克建等[5]对红瓤核桃种皮进行分析证实了其种皮中含有花色苷。李琳等[6]观察了红瓤核桃的生物学特性并对其种仁营养成分进行了分析。红仁核桃内种皮中的酚类物质含量较核桃仁更为丰富，主要包括类黄酮、苯醌、酚酸等活性成分，具有良好的抗氧化活性，有延缓人体衰老、健脑益智、降血糖、抗癌、抑菌等多方面功效[7] [8]。Persic等[9]研究发现红仁核桃中含量最多的酚类化合物是香草酸己苷，另一研究红仁核桃成熟过程中酚类物质的变化，发现红色和棕色品种最大的差异在于前者苯丙氨酸解氨酶、花青素合成酶基因表达增加。

酚类物质在人体内的有效释放及其生物功能的发挥，与其消化、吸收和代谢过程紧密相关，探究酚类物质经消化后的变化情况至关重要。而在生物体内，消化过程涵盖口腔、胃和肠道等多个阶段，物质经过胃和肠道阶段会与体内的消化酶发生作用，涉及物理化学反应，食物会发生转化、降解、不完全释放等反应，从而影响食物的功效性[10]。体外消化模拟是选择与生物相近的pH值、温度条件和主要消化酶去创造接近人体消化环境的方法，检测摄入体内的物质消化吸收情况，评估消化过程对于活性物质的影响[11]。

由于生物活性物质在真实人体内的消化吸收过程非常复杂，存在成本高、耗时长且具有一定的伦理学问题，研究胃肠道消化吸收对食物的影响过程中存在很多困难，更多的学者开始采用体外模拟胃肠道消化的方法去研究食品在胃肠的消化吸收。体外模拟胃肠消化具有快速、廉价、不受伦理限制、重复性高等优势，在食品和营养科学的许多领域被广泛应用[12] [13]。向卓亚等[14]在藜麦体外消化中发现抗氧化性与多酚类和黄酮类物质释放量呈显著正相关。李贻等[15]研究发现，刺梨在模拟胃肠道消化后其多酚、黄酮化合物含量及其DPPH自由基清除能力等均有明显的上升趋势，表明模拟胃肠道消化能促进刺梨中抗氧化成分的释放并使其抗氧化活性提升。

本研究以红仁核桃内种皮提取物为试验对象，基于体外模拟消化系统，在消化过程中分别于口腔、胃、小肠进行试验，筛选出红仁核桃内种皮提取物抗氧化活性较强的阶段，为实现核桃资源的深度开发利用，进一步为核桃多酚、黄酮类化合物作为天然抗氧化剂开发提供理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

本研究所用试验材料与试剂如表1所示。

Table 1. Test materials and reagents

表1. 试验材料与试剂

材料/试剂名称	用量/规格	厂家
红仁核桃	500 g	商洛特产馆
无水乙醇	AR	天津新技术产业园区科茂化学试剂有限公司
α-淀粉酶	BR	上海麦克林生化科技股份有限公司
氯化钠	AR	天津市大茂化学试剂厂
盐酸	AR	天津新技术产业园区科茂化学试剂有限公司
胃蛋白酶	1:10,000	上海麦克林生化科技股份有限公司
氢氧化钠	AR	天津市大茂化学试剂厂
胰蛋白酶	1:250	上海麦克林生化科技股份有限公司
没食子酸	AR	上海麦克林生化科技股份有限公司
福林酚	AR	北京索莱宝科技有限公司
亚硝酸钠	AR	国药集团化学试剂有限公司
硝酸铝	AR	国药集团化学试剂有限公司
芦丁	98%	上海麦克林生化科技股份有限公司
DPPH	AR	上海麦克林生化科技股份有限公司
ABTS	AR	上海麦克林生化科技股份有限公司

2.2. 仪器与设备

本研究所用试验仪器与设备如表2所示。

Table 2. Test instruments and equipment

表2. 试验仪器与设备

仪器名称	厂家
电子天平	日本岛津公司
KQ3200DE数控超声波清洗器	昆山市超声仪器有限公司
旋转蒸发仪	优莱博技术(北京)有限公司
真空冷冻干燥机	北京松源华兴科技发展有限公司
HZS-HA超级水浴恒温振荡器	常州金坛精达仪器制造有限公司
DK-2000-IIIL水浴锅	菲斯福仪器(河北)有限公司
电热鼓风干燥箱	天津市泰斯特仪器有限公司
PH计	上海仪电科学仪器股份有限公司
涡旋混匀仪	广州易测仪器有限公司
紫外可见分光光度计	安捷伦科技有限公司

2.3. 实验方法

2.3.1. 红仁核桃内种皮提取液制备

采用机械法对红仁核桃进行去皮并碾碎，称取30.00 g碾碎核桃皮，采取超声辅助方法提取，温度为45℃、时间为60 min、功率为500 W，提取溶剂为80%乙醇、料液比为1:80 (g/mL)条件下超声提取，残渣在相同条件下再重复提取两次，合并三次上清液，过滤。利用旋转蒸发仪减压浓缩，温度45℃，转速60 rpm，待冷凝管不滴水即可。用真空冷冻干燥机冷冻干燥浓缩液，12 h后得到提取物，将其研磨成粉末用蒸馏水1:45溶解，得到红仁核桃内种皮提取液。

2.3.2. 体外模拟消化

1) 口腔模拟消化

参照倪香艳等[16]的方法并进行改进。在离心管中加入10 mL提取液、10 mL蒸馏水和1 mL α-淀粉酶，置于37℃水浴中以100 rpm振荡10分钟。随后，取上清液于70℃灭酶3分钟并保存。最终，进行总酚、总黄酮含量及抗氧化活性的测定。

2) 胃模拟消化

参照李俶等[17]的方法并进行改进。取60分钟口腔模拟消化后的混合液8 mL，先后加入100 mL 0.9% NaCl溶液和0.5 mL 1 mol/L HCl，再添加10 mL pH 1.5的含160 mg胃蛋白酶的模拟胃液，37℃避光静置。在100 rpm转速下，分别于0、30、60、90、120分钟取样，检测上清液中总酚、总黄酮含量及抗氧化活性。另设生理盐水对照组。

3) 小肠模拟消化

参照闵芳芳等[18]的方法并进行改进。向胃模拟消化后的混合液中逐渐加入0.5 mol/L NaOH调整pH至7.5，随后加入20 mL模拟肠液，搅拌均匀后于37℃避光放置。在100 rpm转速下，分别于0、30、60、90、120分钟取样，测定上清液的总酚、总黄酮含量及抗氧化活性。

以上实验测定重复三次，取平均值数据。

2.3.3. 生物活性物质的测定

1) 总酚含量的测定

总酚的测定参考标准T/GZCX 020-2022 [19]。总酚含量(以没食子酸计)通过以下公式计算：

$X=\frac{\left(C-C_0\right)\times V\times f}{m\times 100}$

其中，X为样品中总酚的含量(mg/g)；C为样品中总酚的浓度(/mL)；$C_0$ 为空白中总酚的浓度(/mL)；m为称取样品的质量(g)；V为提取液体积(mL)；f为稀释倍数。计算结果四舍五入至小数点后两位。

2) 总黄酮含量的测定

总黄酮的测定参考标准T/NAIA 0188-2023 [20]。总黄酮含量(ω, mg/g)按公式计算：

$\omega =\frac{\left(\rho -{\rho }_0\right)\times V_1\times V_3}{m\times V_2\times 100}$

其中，$\rho$ 为试样总黄酮浓度(mg/L)，${\rho }_0$ 为空白样浓度(mg/L)，V₁为提取溶液体积(mL)，V₃为最终定容体积(mL)，m为试样质量(g)，V₂为分取体积(mL)。计算结果保留三位有效数字。

2.3.4. 抗氧化活性的测定

1) DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基清除率的测定参照付丽红等[21]的方法。

取样品待测液3 mL，加入3 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，摇匀避光反应12 min，静置10 min后，于波长517 nm处测吸光度。DPPH清除率计算见式：

$\text{DPPH}清除率=\frac{A_1-\left(A_2-A_3\right)}{A_1}\times 100\%$

式中：A₂为样品组吸光度；A₁为空白组吸光度；A₃为对照组吸光度。

2) ABTS自由基清除率的测定

ABTS自由基清除率的测定参照林心健等[22]的方法。ABTS清除率计算见式：

$\text{ABTS}清除率=\frac{A_0-\left(A_1-A_2\right)}{A_0}\times 100\%$

式中：A₁为样品组吸光度；A₀为空白组吸光度；A₂为对照组吸光度。

2.4. 数据处理

全部实验均重复3次，取平均值。数据分析采用Excel 2021和SPSS 27.0软件，结果以均值 ± 标准差呈现，显著性水平设定为P < 0.05。

3. 结果与分析

3.1. 体外模拟消化红仁核桃内种皮总酚含量变化结果

根据图1可知，消化前红仁核桃内种皮提取物总酚含量为153.21 mg/g，经过口腔模拟消化后，红仁核桃内种皮总酚含量为149.87 mg/g，与消化前相比无显著差异(P > 0.05)。

根据图2可知，在经过胃液模拟消化2 h后，红仁核桃内种皮总酚含量明显上升，达到183.64 mg/g，与消化前相比差异显著(P < 0.05)，说明胃液模拟消化过程对核桃中游离态多酚的析出具有显著促进作用。这可能是因为胃蛋白酶会分解大分子蛋白质，从而使一些被蛋白质包围的多酚类物质释放出来，同时胃蛋白酶也会减弱部分酚酸与细胞壁之间的酯键，使酚酸得以脱离[23]，酸性环境有利于抗氧化物质释放，多酚类物质在低PH值下发生水解，一些苷类化合物变成相应苷元，使多酚含量有所上升。

Figure 1. Changes in total phenolic content of inner seed coat extract of red kernel walnut at different digestion stages

图1. 红仁核桃内种皮提取物在不同消化阶段总酚含量变化

Figure 2. Changes in total phenolic content during gastric simulated digestion of inner seed coat extract of red kernel walnut

图2. 红仁核桃内种皮提取物胃模拟消化过程总酚含量变化

根据图3可知，在经历了小肠模拟消化2 h阶段之后，研究观察到样品内的总酚类物质含量出现了明显下降趋势，其含量为84.98 mg/g，甚至低于未经消化处理的原始样本水平，未消化前的总酚含量是经肠液模拟消化后的1.8倍，与消化前相比差异显著(P < 0.05)。可能由于酚类化合物的代谢转化及其降解过程主要发生在肠道环境中。在此生理区域内，由于趋向碱性的pH条件，大多数酚类物质的化学稳定性受到不利影响，导致它们逐渐发生结构改变和降解反应，进而导致多酚含量降低。

3.2. 体外模拟消化红仁核桃内种皮总黄酮含量变化结果

根据图4可知，消化前红仁核桃内种皮提取物总黄酮含量为0.096 mg/g，未经消化时，红仁核桃内种皮总黄酮含量低，其原因可能是红仁核桃内种皮中单宁和游离多酚的高含量与黄酮形成复合物，抑制了黄酮的提取，同时种皮自身的黄酮含量较低。经过口腔模拟消化后，红仁核桃内种皮总黄酮含量为0.093 mg/g，略有下降，但与消化前相比无显著差异(P > 0.05)。

Figure 3. Changes in total phenolic content during simulated digestion in the small intestine of inner seed coat extract of red kernel walnut

图3. 红仁核桃内种皮提取物小肠模拟消化过程总酚含量变化

Figure 4. Changes in total flavonoid content of inner seed coat extract of red kernel walnut at different digestion stages

图4. 红仁核桃内种皮提取物在不同消化阶段总黄酮含量变化

根据图5可知，在经过胃液模拟消化2 h后，红仁核桃内种皮总黄酮含量达到0.178 mg/g，与消化前相比差异显著(P < 0.05)。黄酮类化合物在体外模拟消化过程中的动态变化模式与总酚类物质含量的波动呈现出高度一致性。具体而言，随着消化进程由胃部向肠道推进，黄酮类化合物的浓度在胃液模拟消化阶段经历了一个上升的趋势，而在后续的肠液模拟消化环节则观察到了一个急剧的含量减少现象。这是由于从酸性的胃液环境中过渡到中性或弱碱性的肠液环境，多酚容易降解为酚醛或其他化合物，造成酚类黄酮类物质含量减少[24]。

根据图6可知，在经历了肠道模拟消化2 h阶段之后，红仁核桃内种皮提取物总黄酮含量为0.091 mg/g，相对于胃液模拟消化阶段，总黄酮释放量下降显著(P < 0.05)。黄酮含量在各个消化阶段展现出的差异性，可能源于各阶段独特的pH环境及消化酶组成之异质性。随着消化过程的递进，不同阶段的酶促水解效率存在显著区别，这直接影响黄酮类化合物的释放速率和总量。此外，在碱性条件下，黄酮类化合物表现出极高的不稳定性，易于经历降解反应，转化为更小的分子结构。

Figure 5. Changes in total flavonoid content during gastric simulated digestion of inner seed coat extract of red kernel walnut

图5. 红仁核桃内种皮提取物胃模拟消化过程总黄酮含量变化

Figure 6. Changes in total flavonoid content during simulated intestinal digestion of the inner seed coat extract of red kernel walnut

图6. 红仁核桃内种皮提取物小肠模拟消化过程总黄酮含量变化

3.3. DPPH自由基清除率测定结果

根据图7可知，消化前红仁核桃内种皮提取物DPPH自由基清除率达到33.28%，因为红仁核桃内种皮富含多酚，特别是儿茶素和原花青素，它们可能通过捐赠氢离子或电子有效清除DPPH自由基，加之黄酮类化合物亦可能参与抗氧化，共同赋予未消化种皮高DPPH自由基清除率，凸显其优异的天然抗氧化潜能。经口腔模拟消化后，红仁核桃内种皮总酚含量为27.43%，下降了5.85%，与消化前相比差异显著(P < 0.05)。

根据图8可知，在经过胃液模拟消化2 h后，随着体外模拟胃消化的不断进行，红仁核桃内种皮经过胃模拟消化后，DPPH自由基清除率增加至43.68%，显著高于消化前和口腔模拟消化组(P < 0.05)。

根据图9可知，在经历了肠道模拟消化2 h阶段之后，DPPH自由基清除率为26.83%，与消化前相比下降了6.45%，与消化前相比差异显著(P < 0.05)。结果表明，红仁核桃内种皮经过体外模拟消化后，其对DPPH自由基清除能力呈下降趋势。

Figure 7. Changes in DPPH free radical scavenging rate of inner seed coat extract of red kernel walnut at different digestion stages

图7. 红仁核桃内种皮提取物在不同消化阶段DPPH自由基清除率变化

Figure 8. Changes in DPPH free radical scavenging rate during gastric simulated digestion of red kernel walnut inner seed coat extract

图8. 红仁核桃内种皮提取物胃模拟消化过程DPPH自由基清除率变化

Figure 9. Changes in DPPH free radical scavenging rate of inner seed coat extract of red kernel walnut in the small intestine during simulated digestion

图9. 红仁核桃内种皮提取物小肠模拟消化过程DPPH自由基清除率变化

3.4. ABTS自由基清除率测定结果

根据图10可知，消化前红仁核桃内种皮提取物ABTS自由基清除率达到84.31%。红仁核桃内种皮富含的多酚化合物展现出了强大的抗氧化潜力。这些多酚分子通过高效的氢或电子供体机制，显著提高了对ABTS自由基的清除效率，同时，内种皮中存在的黄酮类化合物亦可能通过协同作用，进一步加强了自由基的清除能力。经过口腔模拟消化后，核桃内种皮ABTS自由基清除率为75.29%，下降了9.02%，与消化前相比差异显著(P < 0.05)。

根据图11可知，在经过胃液模拟消化2 h后，其清除ABTS自由基的能力显著上升，ABTS自由基清除率为93%，与消化前相比，增加了8.69%，显著高于消化前和口腔模拟消化组(P < 0.05)。

根据图12可知，在经历了肠道模拟消化2 h阶段之后，红仁核桃内种皮提取物ABTS自由基清除率为61.92%，其清除ABTS自由基能力再次下降，与消化前相比下降了22.39%，下降幅度较大。结果表明，红仁核桃内种皮经过体外模拟消化后，其对ABTS自由基清除能力呈下降趋势，其中经胃液模拟消化120 min后的ABTS自由基清除率显著高于其它消化组(P < 0.05)。

Figure 10. Changes of ABTS free radical scavenging rate of inner seed coat extract of red kernel walnut at different digestion stages

图10. 红仁核桃内种皮提取物在不同消化阶段ABTS自由基清除率变化

Figure11. Changes in ABTS free radical scavenging rate of inner seed coat extract of red kernel walnut during gastric simulated digestion

图11. 红仁核桃内种皮提取物胃模拟消化过程ABTS自由基清除率变化

Figure12. Changes in ABTS free radical scavenging rate of inner seed coat extract of red kernel walnut in small intestine during simulated digestion

图12. 红仁核桃内种皮提取物小肠模拟消化过程ABTS自由基清除率变化

3.5. 红仁核桃内种皮体外模拟消化抗氧化活性成分与抗氧化活性的相关性结果

经过对红仁核桃内种皮体外模拟消化后抗氧化能力分析，发现红仁核桃内种皮抗氧化能力经消化道后的变化规律与红仁核桃内种皮经体外模拟消化后含量的变化一致。通过进行皮尔森相关性检验，红仁核桃内种皮经体外模拟消化后总酚、总黄酮与抗氧化活性之间的关联性分析结果如表3所示。从表中可以看出，在体外模拟消化过程中，红仁核桃内种皮总酚浓度与它清除DPPH自由基活性的相关性达到了0.335，具有明显的相关性(P < 0.05)，与ABTS自由基活性的相关性达到了0.930，具有非常明显的相关性(P < 0.01)，红仁核桃内种皮总黄酮浓度与它清除ABTS自由基活性的相关性达到了0.817，具有非常明显的相关性 (P < 0.01)。关联性分析结果表明总酚含量与DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率，总黄酮含量与ABTS自由基清除率密切相关，是影响其消化过程中抗氧化能力变化的关键因素。

Table 3. Correlation between antioxidant active components and antioxidant activity of inner seed coat extract of red kernel walnut

表3. 红仁核桃内种皮提取物抗氧化活性成分与抗氧化活性的相关性

相关系数	DPPH自由基清除率	ABTS自由基清除率
红仁核桃内种皮总酚含量	0.335^*	0.930^**
红仁核桃内种皮总黄酮含量	0.212	0.817^*

注：^**水平为0.01 (双尾)，具有极高的相关性；^*在水平为0.05 (双尾)时，相关性达到了高水平。

4. 讨论与结论

本研究通过建立体外模拟口腔、胃肠道消化模型，比较研究了在口腔、胃、小肠红皮核桃内种皮抗氧化活性的变化。结果发现红皮核桃内种皮经体外模拟消化后总酚、总黄酮含量及抗氧化能力下降。红皮核桃内种皮经口腔模拟消化后含量下降，可能与红皮核桃内种皮会通过特异性作用直接与 a-淀粉酶结合形成大分子化合物，形成不溶性聚合物。在胃模拟消化阶段，胃液模拟消化阶段对多酚化合物的转化具有积极促进作用。在这一阶段，胃蛋白酶的催化效应使得大量酚类物质得以释放，尤其是单宁类化合物倾向于分解成酚酸类物质，从而导致多酚的总含量上升，伴随这一过程，样品的抗氧化潜能相应提升。Bouayed [25]、Tagliazucchi [26]等的研究均表明，样品经模拟胃液消化后多酚释放量和抗氧化活性有所提高。然而，在小肠模拟消化阶段，肠道微生物、胆汁及胰酶协同作用导致酚类物质迅速转化与降解，引起酚类物质含量降低，抗氧化效能减退。模拟消化过程导致酚类及黄酮水平下降，伴随ABTS和DPPH自由基清除能力的减弱，揭示了活性物质含量与抗氧化效能之间的紧密关联，表明抗氧化性能随活性成分含量的变化同步衰退。

研究聚焦于红皮核桃内种皮提取物中的总酚和总黄酮含量，并通过体外模拟消化实验，评估了生物活性在消化过程中对抗氧化活性的影响。初步实验结果表明，红皮核桃内种皮显示出较强的抗氧化特性。然而，考虑到红皮核桃内种皮提取物在实际应用中所遭遇的多变环境因素，其在功能食品领域的应用前景仍需深入探索。诸如对于红皮核桃内种皮在体外模拟消化后具体会转变成什么物质，还需要对提取出来的总酚、总黄酮应该进一步分离、提纯，确定红皮核桃内种皮提取物在不同生理条件下的化学稳定性和生物利用度。

本研究经口腔模拟消化后，红仁核桃内种皮总酚、总黄酮含量以及抗氧化活性与消化前相比略微下降；经胃模拟消化后，红仁核桃内种皮总酚、总黄酮含量以及抗氧化活性与消化前相比显著上升(P < 0.05)；而经过小肠模拟消化后，红仁核桃内种皮总酚、总黄酮含量以及抗氧化活性与消化前相比显著下降(P < 0.05)。皮尔森相关性检验表明，在体外模拟消化过程中，红仁核桃内种皮总酚含量与它清除DPPH自由基活性的相关性为0.335，具有明显的相关性(P < 0.05)，红仁核桃内种皮总酚含量与它清除ABTS自由基活性的相关性达到了0.930，具有非常明显的相关性(P < 0.01)；红仁核桃内种皮总黄酮含量与它清除DPPH自由基活性的相关性为0.212，相关性不明显(P > 0.05)，红仁核桃内种皮总黄酮含量与它清除ABTS自由基活性的相关性达到了0.817，具有非常明显的相关性(P < 0.01)。

基金项目

商洛学院科学研究计划项目(21FK002)；大学生创新创业训练计划项目(202411396007)。