格氏乳杆菌微胶囊包被工艺优化及其效果评估

Optimization of Preparation Process of Encapsulated Lactobacillus gasseri Microcapsules and Its Effect Evaluation

摘要: [目的]为进一步提高格氏乳杆菌的抗逆能力，扩大其应用领域。[方法]通过筛选合适壁材，利用乳化法对格氏乳杆菌进行微胶囊包被，并借助测定微胶囊物理特性(包被率、粒径大小、外观结构)、胃肠道性能(耐酸性、耐胆盐)及稳定性(热稳定性、储存稳定性)等方面，评估微胶囊对目标菌的保护效果。[结果]结果显示，海藻酸钠和瓜尔豆胶的组合为最优复合壁材，其最佳包被工艺为：搅拌速度500 r/min、目标菌数量10¹⁰ CFU/mL、瓜尔豆胶浓度0.5%、水油比1:3，此工艺条件目标菌的包埋率为50.01% ± 2.56%，平均粒径为713.38 ± 14.30 μm，具有较好的圆形度和表面均匀度，胃肠道性能方面，复合壁材包被的格氏乳杆菌经模拟胃肠液作用后，活菌数分别为1.55 × 10⁶ CFU和1.73 × 10⁶ CFU，与2.5%海藻酸钠组相比差异极显著(P < 0.01)，稳定性方面，复合壁材也表现出对格氏乳杆菌更好的保护作用(P < 0.01)。[结论]上述结果说明，在最佳包被壁材和包被工艺下获得的微胶囊对格氏乳杆菌有较好的包载效果和充分的保护作用，有利于其应用领域的进一步扩大。

Abstract: [Objective] In order to further improve the stress resistance of Lactobacillus gasseri and expand its application field. [Methods] Microcapsules were prepared via emulsification method by screening suitable wall materials, and the protective effect of microcapsules on target bacteria was evaluated by measuring the physical properties (coating rate, particle size, appearance structure), gastrointestinal performance (acid resistance, bile salt resistance) and stability (thermal stability, storage stability). [Results] The results showed that the combination of sodium alginate and guar gum was the optimal composite wall material, and the optimal coating process was as follows: stirring speed 500 r/min, number of target bacteria 10¹⁰ CFU/mL, concentration of guar gum 0.5%, water-oil ratio of 1:3, encapsulation yield of target bacteria under these process conditions was 50.01% ± 2.56%, the average particle size was 713.38 ± 14.30 μm, and it had good circularity and surface uniformity. In terms of gastrointestinal performance, the number of viable bacteria in the composite wall-coated Lactobacillus gasseri was 1.55 × 10⁶ CFU and 1.73 × 10⁶ CFU, respectively, which was significantly different from that of the 2.5% sodium alginate group (P < 0.01). As for stability, the composite wall material also showed better protection against Lactobacillus gasseri (P < 0.01). [Conclusion]The above results show that the microcapsules obtained under the optimal coating wall material and coating process have a good encapsulation effect and sufficient protective effect on Lactobacillus gassei, which is conducive to the further expansion of its application field.

1. 引言

格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，是一类革兰氏阳性菌，又称为加氏乳杆菌，是存在于胃肠道、阴道或母乳中的天然菌丛，被美国FDA定义为一般公认安全类添加剂(Generally Recognized as Safe, GRAS)状态微生物，也是我国国家卫生健康委员会批准的可用于食品的益生菌之一。格氏乳杆菌具有耐酸、耐胆汁、与寄主粘附等特性，主要通过产生乳酸、细菌素和过氧化氢，降解草酸，排除病原体等，发挥其抗菌、调整免疫功能、维持微生态平衡、缓解幽门螺杆菌感染和改善腹泻等多种功能[1] [2]。

近些年来，国内外学者对格氏乳杆菌的益生性研究如火如荼，发现其在食品、医药行业具有广大应用前景，并已有相关产品上市，如添加了格氏乳杆菌LG21的日本明治Probio酸奶，加入有格氏乳杆菌Lg-36的德国“Nutrilife肠源性益生胶囊”，还有以格氏乳杆菌为核心菌种的我国三元衡安堂166酸奶。

然而，格氏乳杆菌作为厌氧菌，易受外界氧气等不良环境影响，另外其在低酸环境中存活率也不高(如pH = 2时，其存活率仅为2%)。利用海藻酸钠和其它多聚物的复合壁材对目标菌进行微胶囊化处理是保护目标菌的有效手段[3]。本研究通过筛选优化与海藻酸钠复合的壁材种类和微胶囊制备工艺，获得包被格氏乳杆菌微胶囊，并通过检测其包被效率、粒径大小、耐酸性、耐胆盐、耐热以及储存稳定性等特性，评估微胶囊对目标菌的保护性能，为扩大格氏乳杆菌使用范围及微生物制剂产品的研发提供依据。

2. 材料与方法

2.1. 材料

格氏乳杆菌，分离自天然酸面团；MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基，购自北京陆桥技术股份有限公司；海藻酸钠、瓜尔豆胶购至上海源叶生物科技有限公司，茯苓和党参购至北京同仁堂药店；胰酶粉(4活性单位/mg)、胃蛋白酶(≥250活性单位/mg)购自Sigma (上海)。CaCl₂ (分析纯)、NaCl (分析纯)、NaOH (分析纯)；KH₂PO₄ (分析纯)、磷酸缓冲液(PBS)、吐温−80、猪胆盐和盐酸，购自国药集团化学试剂有限公司；鲁花大豆油，购自山东鲁花集团有限公司。

2.2. 方法

2.2.1. 目标菌培养

冻存的格氏乳杆菌甘油管室温溶化后分区划线接种于MRS固体培养基，37℃培养复苏48 h，挑取单菌落，接种于50 mL三角瓶(装增殖培养基50 mL)，37℃静置培养24 h左右，按2%的接种量再次接种于50 mL三角瓶(装液50 mL增殖培养基)，37℃静止培养12~16 h，然后5000 ×g、4℃条件下离心10 min，菌泥用生理盐水重悬，使其终浓度为1.0 × 10⁹ CFU/mL左右[4]。

2.2.2. 微胶囊包被工艺及壁材筛选

2种药食同源性中草药(茯苓、党参)购自同仁堂药店，用前粉碎后过40目筛。100 mL 2.5%的海藻酸钠溶液[5]，或2.5%海藻酸钠与1%的魔芋胶、瓜尔豆胶以及两种中草药茯苓和党参的复合溶液灭菌冷却至38℃~40℃后，与一定活菌数的目标菌菌泥混合，搅拌均匀后，按照一定的水油比加入到大豆油中(含有0.5%吐温−80 (w/v))，在磁力搅拌器上500 rpm转速搅拌30 min直到完全乳化，然后沿器壁快速(20 mL/s)加入100 mL、0.1 mol/L的CaCl₂溶液，低速搅拌至水油两相分离(30 min左右)，最后在350 ×g (1950 rpm)、10 min条件下离心收集微胶囊，并用0.1 mol/L的CaCl₂溶液漂洗2次，同条件下收集微胶囊放置4℃过夜(12 h) [6] [7]。8层无菌纱布滤去多余水分后，备用。

2.2.3. 格氏乳杆菌微胶囊制备工艺优化

根据前期实验结果，选择对微胶囊中菌体包埋率影响较大的搅拌速度、目标菌数量、复合壁材浓度和水油比进行正交试验。以微胶囊中菌体的包埋率为指标，设计四因素三水平的正交试验(见表1)，确定格氏乳杆菌微胶囊最佳制备工艺。

Table 1. Factors and levels for test

表1. 试验因素水平表

水平	因素
	搅拌速度(A)	目标菌数量(B)	复合壁材浓度(C)	水油比(D)
1	400 rpm	10^8 CFU/mL	0.5%	1:3
2	500 rpm	10^9 CFU/mL	1%	1:4
3	600 rpm	10^10 CFU/mL	1.5%	1:5

2.2.4. 最佳工艺验证和包被效果评估

根据优化工艺包被目标菌，并对其形态结构、胃肠液保护效果、胃肠液释放性能、热稳定性和储存稳定性进行评估。

2.2.5. 微胶囊包被效果评估

1) 微胶囊包埋率的测定[8]

$包埋率\left(\%\right)=\frac{微胶囊中活菌数量}{初始活菌数量}\times 100\%$

式中：微胶囊中活菌数量为每克湿微球的含菌量与微球总重量的乘积；初始活菌数量为每毫升浓缩菌液的含菌量与浓缩菌液总体积的乘积。

活菌计数方法：取1 ml样液加入到9 mL、0.2 moL/L、pH 8.0的磷酸缓冲液，37℃温育10 min，然后用旋涡振荡器(或摇床)震荡10 min，并用均质机均质30 s，以彻底从微胶囊中释放目标菌，然后用生理盐水溶液进行梯度稀释至合适浓度，涂布MRS琼脂平板，37℃、24 h左右，计算活菌数。每个样品重复三次。

2) 格氏乳杆菌微胶囊的形态观察及粒径分布

用移液枪吸取少量微胶囊分散溶液置于载玻片上，滴加适量甲基蓝溶液(便于观察)，盖上盖玻片，用生物显微镜对其进行形态观察并拍照。采用Beckman Coulter LS 2000激光粒度分析仪测定其粒径分布。

3) 微胶囊在胃肠液中对目标菌的保护效果评估[9]

胃液配制：取浓度为1 mol/ml的稀盐酸，加水稀释，将pH值调至1.5。每100 ml液体中加入1 g胃蛋白酶，混匀，用0.22 μm的无菌滤头过滤待用。

肠液配制：取KH₂PO₄ 6.8 g加水500 ml溶解，用0.4% (w/w)的NaOH回调pH值至6.8。每100 ml液体中加入1 g胰酶粉和2 g的猪胆盐，混匀，用0.22 μm的无菌滤头过滤待用。

实验处理：取1 g各种微胶囊，接入含有15 ml胃液(pH值1.5)的灭菌三角瓶内(带橡胶塞)，37℃、110 r/min、培养2 h。同时，胃液培养结束后，取1 g各种微胶囊，接入含有15 ml肠液的灭菌三角瓶中(pH值6.8)，37℃、110 r/min、培养4 h。分别在胃液和肠液培养结束时，按1)中方法进行活菌计数，按下式进行保护效果计算：

$胃液中存活率\left(\%\right)=\frac{胃液作用后的活菌数\left(\text{CFU}/\text{g}\right)}{微胶囊中原有活菌数\left(\text{CFU}/\text{g}\right)}\times 100\%$

$肠液中存活率\left(\%\right)=\frac{肠液作用后的活菌数\left(\text{CFU}/\text{g}\right)}{微胶囊中原有活菌数\left(\text{CFU}/\text{g}\right)}\times 100\%$

4) 微胶囊热稳定性评估[10]

取0.5 g上述微胶囊产品或0.5 mL目标菌原液，加入4.5 mL PBS溶液(pH 6.5)，然后在60℃、70℃和80℃下分别处理15 min，冷却至室温后，采用1)中的方法对产品进行活菌计数，判断样品在不同温度下的热稳定性。

5) 微胶囊储存稳定性评估

取适量上述微胶囊产品，在37℃、70%湿度下进行加速储存实验，并分别在0天、7天、1个月、2个月取样，每个处理3个重复。然后采用1)中方法对产品进行活菌计数，判断样品的储存稳定性。

3. 实验结果

3.1. 复合壁材的筛选

表2展示了2.5%海藻酸钠和不同壁材复合后所形成的微胶囊的包埋率和粒径分布。对比发现，魔芋胶和瓜尔豆胶分别与海藻酸钠复合后，均有效提升了目标菌的包埋率(均P < 0.01)，但其粒径平均值也提高近2倍；然而，茯苓和党参分别与海藻酸钠复合后，却得到了相反的结果。同时，对比2.5%海藻酸钠 + 1%魔芋胶微胶囊和2.5%海藻酸钠 + 1%瓜尔豆胶微胶囊发现，2.5%海藻酸钠 + 1%瓜尔豆胶微胶囊具有更高的包埋率(P < 0.05)和更小的粒径平均值(P < 0.01)。因此，选择2.5%海藻酸钠 + 1%瓜尔豆胶作为后续研究的壁材组合。

Table 2. Entrapped efficiency and diameter of microcapsules with various composite wall materials

表2. 各种复合壁材微胶囊包埋率及粒径大小

微胶囊	包埋率(%)	粒径平均值(μm)
2.5%海藻酸钠	28.35 ± 3.84	388.80 ± 10.54
2.5%海藻酸钠 + 1%魔芋胶	41.18 ± 1.23	760.70 ± 12.40
2.5%海藻酸钠 + 1%瓜尔豆胶	46.24 ± 2.59	736.58 ± 18.68
2.5%海藻酸钠 + 1%茯苓	15.95 ± 1.00	309.34 ± 6.87
2.5%海藻酸钠 + 1%党参	12.32 ± 1.48	232.21 ± 7.55

3.2. 微胶囊制备工艺优化

Table 3. Orthogonal array and results of the experiments

表3. 正交实验安排及结果

序号	因素				包埋率/(%)
	A：搅拌速度 (rpm)	B：目标菌数量 (CFU/mL)	C：瓜尔豆胶 浓度(%)	D：水油比
1	400	108	0.5	1:3	30.73
2	400	109	1	1:4	32.39
3	400	1010	1.5	1:5	35.45
4	500	108	1	1:5	36.46
5	500	109	1.5	1:3	43.63
6	500	1010	0.5	1:4	49.52
7	600	108	1.5	1:4	38.48
8	600	109	0.5	1:5	43.94
9	600	1010	1	1:3	47.17
K1	98.57	105.67	124.19	121.53
K2	129.61	119.96	116.02	120.39
K3	129.59	132.14	117.56	115.85
R	31.04	26.47	8.17	5.68

Ki指同一因素同一水平的和，R是Ki最大值和最小值的差。

根据表3结果，通过对试验结果进行极差(R值)分析可知，各因素对包埋率的影响程度大小顺序为A > B > C > D，即：搅拌速度 > 目标菌数量 > 瓜尔豆胶浓度 > 水油比。最佳的工艺条件组合为A2B3C1D1，即搅拌速度500 r/min、目标菌数量10¹⁰ CFU/mL、瓜尔豆胶浓度0.5%、水油比1:3，以此最佳制备工艺条件进行重复验证试验，测得平均包埋率为50.01% ± 2.56%，优于表3中的最高包埋率。

3.3. 最佳工艺条件下微胶囊包被效果评估

3.3.1. 形态观察及粒径分布

由图1可知，在电子显微镜下，复合壁材微胶囊(2.5%海藻酸钠 + 0.5%瓜尔豆胶)相比单独海藻酸钠微胶囊具有较好的圆形度，表面均匀程度也更好；粒径方面，复合壁材微胶囊平均粒径为713.38 ± 14.30 μm，与2.5%海藻酸钠微胶囊相比，差异极显著(P < 0.01)，同时也发现，瓜尔豆胶的加入，在增加了微胶囊的粒径的同时，其粒径变化范围较大(变异系数大)，会在一定程度上影响微胶囊的均匀度。

Figure 1. Microscope images of Lactobacillus gasseri microcapsules (×40)

图1. 格氏乳杆菌微胶囊显微镜图(×40)

3.3.2. 微胶囊包被目标菌在模拟胃肠液中的存活性能

如表4所示，未包被格氏乳杆菌在模拟胃液(pH值1.5)中作用2 h后，其存活率为0；虽然2.5%海藻酸钠作为壁材包被的格氏乳杆菌经模拟胃液作用2 h后，活菌数也不足10⁶ CFU，但与未包被组相比，差异极显著(P < 0.01)；而复合壁材包被的格氏乳杆菌经模拟胃液作用2 h后，存活率达到(0.49 ± 0.02)%，活菌数为1.55 × 10⁶ CFU，与2.5%海藻酸钠组相比差异极显著(P < 0.01)。

类似的结果也表现在模拟肠液中，复合壁材包被的格氏乳杆菌经模拟肠液作用4 h后，存活率达到(0.55 ± 0.01)%，活菌数为1.73 × 10⁶ CFU，与2.5%海藻酸钠组和未包被组相比差异极显著(P < 0.01)。

Table 4. Survivability of entrapped Lactobacillus gasseri under different treatment conditions in simulated GI conditions

表4. 不同处理格式乳杆菌在模拟胃肠液中的存活率

微胶囊	样品活菌数(CFU)	胃液作用后活菌数(CFU)	胃液存活率(%)	肠液作用后活菌数(CFU)	肠液存活率(%)
未包被	1 × 10^9	<1 × 10^3	0a	<1 × 10^3	0a
2.5%海藻酸钠	2.01 × 10^8	1.43 × 10^5	0.07 ± 0.01b	0.33 × 10^6	0.16 ± 0.01b
2.5%海藻酸钠 + 0.5%瓜尔豆胶	3.15 × 10^8	1.55 × 10^6	0.49 ± 0.02c	1.73 × 10^6	0.55 ± 0.01c

3.3.3. 微胶囊包被目标菌的热稳定性

根据图2，未包被目标菌在60℃、70℃和80℃作用15 min后，活菌数从9.00分别下降到4.50、3.91和2.65 1 g CFU/mL，而两种微胶囊包被的目标菌在3个温度下的存活数分别比未包被目标菌高出1.5~3个lg值、1.5~2.2个lg值和1~2.2个lg值。同时，两种微胶囊相比发现，复合壁材包被的格氏乳杆菌80℃下依然保存有4.88个lg值的活菌数(接近10⁵ CFU)，显著高于海藻酸钠微胶囊的3.55个lg值，说明复合壁材包被对格氏乳杆菌的保护作用更明显。

Figure 2. The viability of free and encapsulated Lactobacillus gasseri at 60˚C, 70˚C and 80˚C

图2. 不同处理格氏乳杆菌在60˚C, 70˚C and 80˚C下的稳定性

3.3.4. 微胶囊包被目标菌的储存稳定性

图3比较了不同处理的格氏乳杆菌在37℃及70%湿度环境中储存不同时间后的活菌数。

Figure 3. The storage stability of free and encapsulated Lactobacillus gasseri at 37˚C

图3. 不同处理格氏乳杆菌在37℃环境中的储存稳定性

根据表中结果，未包被目标菌在37℃及70%湿度环境中2个月后活菌数已经无法检测到；海藻酸钠微胶囊1个月后保持了1.05 × 10⁶ CFU活菌数，但2个月后则降至3.35 × 10⁴ CFU的活菌数；而复合壁材微胶囊2个月后仍有8.27 × 10⁵ CFU的活菌数。

4. 分析讨论

4.1. 微胶囊壁材筛选与工艺优化

海藻酸钠作为微胶囊的常用壁材，其单独使用时存在着不耐低酸环境、形成的微胶囊多孔等问题[11]，因此诸多研究和生产实际中多采用海藻酸钠和其他多聚物(如淀粉、果胶)进行复合包被目标菌，并取得不错的效果[12]。本研究中，与海藻酸钠复合的四种壁材所形成的微胶囊，海藻酸钠与魔芋胶组合、海藻酸钠与瓜尔豆胶组合均有效提升了对目标菌的包埋率(P < 0.01)，这主要和魔芋胶以及瓜尔豆胶的主要成分是聚糖有关，其较强的黏附性提高了微胶囊对目标菌的捕获，提高包埋率。微胶囊粒径方面，复合壁材与单独海藻酸钠微胶囊相比也显著增大(P < 0.01)，这可能和魔芋胶以及瓜尔豆胶中存在的亲水基团(乙酰基)或活性基团(羟基)有关，因为这些基团能够和水分子或其他活性基团通过氢键或酯化反应形成具有较强持水性能的溶胀结构，使微胶囊粒径增大[13]-[15]。另外对比发现，海藻酸钠与瓜尔豆胶组合对目标菌的包埋率更高(P < 0.05)，这可能和瓜尔豆胶与其他胶体相比，具有最佳的分散性、吸水性、持水性以及黏性有关系[16] [17]。

对最佳壁材组合的微胶囊包被工艺进行优化，结果发现，搅拌速度500 r/min、目标菌数量10¹⁰ CFU/mL、瓜尔豆胶浓度0.5%、水油比1:3为最佳工艺条件，且各因素中对包埋率的影响最大的为搅拌速度，这和李乔的研究结果相一致[18]。最佳制备工艺条件下，复合壁材对目标菌的包埋率达到了50.01% ± 2.56%，但该包埋率与部分研究相比[19] [20]，包埋率偏低，这可能主要和微胶囊的制备方法和工艺流程不同有关系，比如冯明星等的研究采用的是真空状态下液态微胶囊的制备方法。

4.2. 最佳工艺包被效果评估

4.2.1. 形态观察及粒径分布

作为评价微胶囊的一个重要指标，粒径大小不但和微胶囊包被目标菌存活性能有关系，也直接影响着产品的口感(食品)或适口性(饲料)，并且通常受到壁材种类和浓度的影响。本研究中瓜尔豆胶的复合使微胶囊的粒径增大了近两倍，且随着壁材浓度的增加而增大(和1%瓜尔豆胶相比)，这和一些学者的研究结果相似[21]。然而，Krasaekoopt和Watcharapoka的研究发现，在嗜酸乳杆菌(Lactobacillus. acidophilus 5)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei 01)的包被壁材中加入菊粉，使微胶囊的粒径增加了大约3.8%，但和加入的菊粉的浓度没有关系[22]。这可能由于使用的壁材类型和乳酸菌的种类的不同，导致微胶囊ζ-电位发生变化[21]。

4.2.2. 微胶囊包被目标菌在模拟胃肠液中的存活性能

采用复合壁材包被目标菌，主要目的是解决单独海藻酸钠形成的微胶囊存在的多孔的问题，电子显微镜下虽然不能有效观察瓜尔豆胶对单独海藻酸钠所形成微胶囊的多孔缺点的弥补(需要借助扫描电镜)，但复合壁材微胶囊对目标菌的保护效果的提升充分说明了这一点。本研究中，无论是在模拟胃液中还是模拟肠液中，复合壁材包被的格氏乳杆菌的存活能力，比单独海藻酸钠形成的微胶囊均有大幅度提高，这也和目前的相关研究结果一致[23]。

另外，对比发现，同样包被壁材的微胶囊对格氏乳杆菌具有更好的保护效果，这可能和格氏乳杆菌具有更强的耐酸、耐胆盐能力有关[24]。

4.2.3. 微胶囊包被目标菌的热稳定性和储存稳定性

乳酸菌作为添加剂加入到人类食品或动物饲料中时，其活性受到其加工过程(如加热)的影响，同时空气中的氧气也对多为厌氧菌的乳酸菌有较大杀伤力，从而影响食品的营养价值和货架期">。微胶囊处理是控制这种损伤的有效方法之一。根据图2的结果，单独海藻酸钠和海藻酸钠 + 瓜尔豆胶的复合壁材包被格氏乳杆菌，都对目标菌耐受高温的能力有较大的促进作用，并且复合壁材对目标菌的保护效果比单一壁材更加显著。同时，37℃、70%湿度下进行加速储存实验也表明(图3)，复合壁材微胶囊在此条件下2个月后仍有10⁶ CFU左右的活菌数，这个结果相当于常温条件下保存半年。

上述结果说明，包被材料，尤其是复合材料，为目标菌提供了更好的屏蔽热杀伤的作用和其他不良环境条件的影响，提高了乳酸菌的耐热性能和储存稳定性，从而提升了乳酸菌制剂的安全性和延长其货架期，以利于其运输、加工和实际应用。

5. 结论

通过筛选获得最优壁材组合为海藻酸钠和瓜尔豆胶，优化后的最佳包被工艺为：搅拌速度500 r/min、目标菌数量10¹⁰ CFU/mL、瓜尔豆胶浓度0.5%、水油比1:3；此工艺条件下不但有效提高了对格氏乳杆菌的包埋率，也有效改善了微胶囊的圆形度和表面均匀度；更重要的是，极显著地促进了格氏乳杆菌抵抗胃液低酸，肠道胆盐，以及外界温度、湿度、O₂和压力等不利条件的能力，增强了其耐受性、存活率和稳定性，为格氏乳杆菌的规模化生产实践的应用和微生态制剂产品的研发提供基础数据和技术支撑。但也发现，在最佳制备工艺条件下，目标菌的包埋率为50.01% ± 2.56%，与理想值仍有一定差距，说明该包埋体系仍有优化空间。可能原因在于海藻酸钠与瓜尔豆胶的协同凝胶作用未完全发挥，或交联过程中的钙离子扩散不均导致微胶囊内部结构疏松。后续可进一步探究复合壁材比例、交联时间及固化方式对包埋效果的影响，以提升微胶囊的致密性与包埋效率，同时评估其在模拟胃肠液中的释放特性，为实际应用提供更精准的工艺参数支持。

基金项目

北京农业职业学院首席专家团队项目(项目编号：XY-TD-22-04)，北京农业职业学院大学生双创项目(项目编号：XY-XK-22-05)，北京农业职业学院校级科研创新团队项目(项目编号：XY-TD-25-03)。

NOTES

^*通讯作者。