黄芪多糖提取工艺及其体外抗氧化活性研究

An Investigation into the Extraction Process and Antioxidant Activity in Vitro of Astragalus Polysaccharides

摘要: 以黄芪为原料，乙醇为溶剂，在单因素试验基础上通过正交试验对黄芪多糖提取工艺进行优化，并对黄芪多糖抗氧化活性进行研究。结果表明：最佳提取工艺条件为料液比1:40 g/mL，乙醇浓度40%，提取温度50℃，在此条件下黄芪多糖提取率为21.13%。黄芪多糖对DPPH、ABTS和羟基自由基具有一定的自由基清除能力，其半抑制浓度IC₅₀分别为0.662、0.813和1.116 mg/mL。

Abstract: Using astragalus as the raw material and ethanol as the solvent, the extraction process of astragalus polysaccharides was optimized through orthogonal tests based on single-factor experiments, and the antioxidant activity of the polysaccharides was investigated. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows: solid-to-liquid ratio of 1:40 g/mL, ethanol concentration of 40%, and extraction temperature of 50˚C. Under these conditions, the extraction yield of astragalus polysaccharides reached 21.13%. The polysaccharides exhibited certain free radical scavenging abilities against DPPH, ABTS, and hydroxyl radicals, with half-maximal inhibitory concentration (IC₅₀) values of 0.662, 0.813, and 1.116 mg/mL, respectively.

1. 引言

黄芪(Radix astragali)是豆科、黄芪属植物。广泛分布于中国的东北、华北、西北等地区。它生长在森林边缘、灌丛中、林下，以及草地和山坡牧场。黄芪根可以入药，味甘，性微温，具补气固表、利尿、强心、降压、抗菌等功效，可用于治疗表虚自汗、气虚内伤、脾虚泄泻、浮肿及痈疽等[1]。黄芪主要成分包括多糖、皂苷、黄酮、香豆素等，表现出调节免疫、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、调节血糖等药理活性。本研究在单因素试验基础上，设计三因素三水平正交试验，得到黄芪多糖的最佳提取工艺，并评价黄芪多糖体外抗氧化活性，为中药材黄芪研究提供理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 材料与试剂

黄芪由贵州工程应用技术学院天然产物实验室提供。葡萄糖标准品(北京万佳首化生物科技有限公司商城分公司)；无水乙醇和浓硫酸(成都市科隆化学品有限公司)；苯酚(成都金山化学试剂有限公司)；自由基试剂(DPPH, ABTS) (飞净生物科技有限公司)；过硫酸钾(上海易恩化学技术有限公司)；抗坏血酸(VC，天津市致远化学试剂有限公司)；FeSO₄∙7H₂O₂ (上海麦克林生化科技股份有限公司)。

2.2. 仪器与设备

RE-2000B型旋转蒸发器(郑州华辰仪器有限公司)；FA224X型电子分析天平(天津市德安特传感技术有限公司)；XF-100型粉碎机(东莞市房太电器有限公司)；UV-5800紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)。

2.3. 方法

2.3.1. 黄芪预处理

将黄芪切片干燥后粉碎180 s，过筛(60目)，备用。

2.3.2. 标准曲线的绘制

称取10 mg葡萄糖置于100 mL容量瓶定容。先分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，再加蒸馏水至2.0 mL，加1 mL 6%苯酚溶液，迅速加入5 mL浓硫酸，混匀，冷却至常温后在490 nm测定吸光度，并绘制标准曲线[2]，得到标准曲线线性回归方程y = 12.96x + 0.0542，相关系数为R² = 0.9996。

2.3.3. 黄芪多糖提取率的计算

取5 g黄芪粉末，按照设定的料液比、乙醇浓度、提取温度和提取时间进行提取。过滤浓缩，定容到100 mL。计算黄芪多糖的含量和提取率。

将浓缩并定容至100 mL的提取液稀释200倍，再取2 mL稀释200倍的提取液，按照“2.3.2”测定吸光度，然后代入标准曲线线性回归方程计算黄芪多糖提取浓度。然后按照下列公式计算提取率：

$黄芪多糖提取率\left(\%\right)=\frac{c\times V\times K}{m\times 1000}\times 100$

式中c为标准曲线计算出的黄芪多糖浓度(mg/mL)；V为定容体积(mL)；K为稀释倍数；m为黄芪粉末质量(g)。

2.3.4. 单因素试验

以黄芪多糖提取率为评价指标，分别考察液料比(1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60 g/mL)、乙醇浓度(40, 50%, 60%, 70%, 80%)、提取温度(30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃)、提取时间(0.5 h, 1.0 h, 1.5 h, 2 h, 2.5 h)对多糖提取率的影响。

2.3.5. 正交试验设计

选择影响比较大的三个因素做正交试验设计，以料液比(A)，乙醇浓度(B)，提取温度(C)为自变量，以黄芪多糖的提取率为响应值(Y)。设计水平见表1。

Table 1. Orthogonal experiment design factors and levels

表1. 正交试验设计因素与水平

水平	A液料比(g/mL)	B乙醇浓度(%)	C提取温度(℃)
−1	1:30	40	40
0	1:40	50	50
1	1:50	60	60

2.3.6. 体外抗氧化活性试验

1) 清除DPPH自由基试验

参照文献[3]，分别取0.2、0.4、0.6、0.8、0.1 mg/mL的黄芪多糖溶液1.5 mL于试管中，加入1.0 mL浓度为0.2 mmol的DPPH溶液，混匀暗环境反应30 min，紫外517 nm处测定吸光度值。对照组中加入相同量的无水乙醇，空白组用去离子水代替黄芪多糖溶液，以VC作对照。按照以下列公式计算黄芪多糖的DPPH自由基清除率：

$\text{DPPH}自由基清除率\left(\%\right)=\left(1-\frac{A_0-A_a}{A_b}\right)\times 100$

式中：A₀为样品的吸光值；A_a为无水乙醇溶液的吸光度；A_b为空白组吸光度。

2) 清除ABTS自由基试验

参照文献[4]，将ABTS (7 mmol/L, 5 mL)和过硫酸钾溶液(140 mmol/L, 12 mL)混合，室温避光反应15 h，制成ABTS自由基溶液，备用。然后用无水乙醇稀释42倍配制成ABTS工作液。分别取0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL，1.0 mg/mL的黄芪多糖溶液1.0 mL于试管中，加2.5 mL ABTS自由基工作液，避光反应1 h，测定734 nm处的吸光值[4]。空白组用1 mL去离子水代替黄芪多糖溶液，以VC为对照。按照以下列公式计算黄芪多糖的ABTS自由基清除率：

$\text{ABTS}自由基清除率\left(\%\right)=\frac{A_0-A_x}{A_0}\times 100$

式中：A_x为样品的吸光值；A₀空白组的吸光度。

3) 清除羟基自由基试验

参照文献[5]，分别配制3 mmol/L FeSO₄溶液，1.8 mmol/L的水杨酸溶液，6 mmol/L H₂O₂。分别取0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL，1.0 mg/mL的黄芪多糖溶液1.0 mL于试管中，依次加入2 mL FeSO₄溶液和1.5 mL水杨酸溶液，加入2 mL H₂O₂开始反应，10 min后测定510 nm处吸光度。空白组用1 mL去离子水代替黄芪多糖溶液，以VC为对照。按照以下列公式计算黄芪多糖的羟基自由基清除率：

$羟基自由基清除率\left(\%\right)=\frac{A_0-A_c}{A_0}\times 100$

式中：A_c为样品的吸光值；A₀空白组的吸光度。

3. 结果与分析

3.1. 单因素试验结果

3.1.1. 液料比对黄芪多糖提取率的影响

由图1可知，当料液比为1:40 g/mL时，黄芪多糖的提取率达到最高。分析其原因，可能是溶剂较少时，黄芪多糖不能完全溶出；溶剂较多时，物料浓度较低导致多糖不能很好地溶出。

Figure 1. Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of Astragalus polysaccharide

图1. 料液比对黄芪多糖提取率的影响

3.1.2. 乙醇浓度对黄芪多糖提取率的影响

如图2所示，当乙醇浓度50%时，黄芪多糖的提取率达到最高。黄芪多糖的提取率随乙醇浓度的提高而降低，这可能是由于乙醇浓度增加引起多糖的活性及结构变化而导致的。也可能是随着乙醇浓度的变大，黄芪中的黄酮成分比黄芪多糖更容易被提取，从而导致黄芪多糖的提取率减小。

Figure 2. Effect of ethanol concentration on extraction yield of Astragalus polysaccharide

图2. 乙醇浓度对黄芪多糖提取率的影响

3.1.3. 提取温度对黄芪多糖提取率的影响

由图3可知，当提取温度为50℃时，黄芪多糖的提取率达到最高。温度超过50℃，黄芪多糖的提取率降低。可能是黄芪多糖结构可能会受损，活性减弱，从而影响苯酚–硫酸法测定的吸光度，提取率降低。

Figure 3. Effect of extraction temperature on extraction yield of Astragalus polysaccharide

图3. 提取温度对黄芪多糖提取率的影响

3.1.4. 提取时间对黄芪多糖提取率的影响

从图4中观察到，当提取时间为60 min时，黄芪多糖的提取率达到最高。但随着提取时间增加，黄芪多糖的提取率逐渐降低。这说明黄芪多糖60 min溶出逐渐增加，随后溶出变慢，且伴随其他杂质的溶出，导致黄芪多糖减少。

Figure 4. Effect of extraction time on extraction yield of Astragalus polysaccharide

图4. 提取时间对黄芪多糖提取率的影响

3.2. 正交试验结果

3.2.1. 正交试验分析

采用三因素三水平的正交试验设计(使用L9(34)表)，试验结果如表2所示。

根据表2中的极差值分析，影响黄芪多糖提取率的主要因素依次是提取温度、料液比和乙醇浓度。其中，提取温度和料液比对提取率的影响显著，而乙醇浓度的影响相对较小。通过正交试验得出，最佳提取条件为料液比1:40 g/mL，乙醇浓度40%，提取温度50℃，对应的工艺参数是A₂B₁C₂。

Table 2. Orthogonal experiment design and results

表2. 正交试验设计与结果

试验号	A料液比(g/mL)	B乙醇浓度(%)	C提取温度(℃)	黄芪多糖提取率/%
1	1:30	40	40	17.4
2	1:30	50	50	19.9
3	1:30	60	60	19.6
4	1:40	40	50	21.6
5	1:40	50	60	19.1
6	1:40	60	40	18.6
7	1:50	40	60	20.7
8	1:50	50	40	18.6
9	1:50	60	50	19.3
均值1	18.967	19.900	18.200
均值2	19.767	19.200	20.267
均值3	19.533	19.167	19.800
极差	0.800	0.733	2.070

3.2.2. 验证性试验

为验证响应面试验预测参数的可行性，以液料比1:40 g/mL、乙醇浓度40%、提取温度50℃，提取时间为60 min，重复三次试验，得到黄芪多糖提取率为21.13%，与正交试验结果基本一致。

3.3. 体外抗氧化试验结果

3.3.1. DPPH自由基清除能力

如图5所示，随着黄芪多糖浓度的增加，对DPPH自由基的清除率逐渐增大。黄芪多糖对DPPH自由基表现出一定的清除作用，IC₅₀为0.662 mg/mL。

Figure 5. Scavenging rate of Astragalus polysaccharide on DPPH free radical

图5. 黄芪多糖对DPPH自由基的清除率

3.3.2. ABTS自由基清除能力

如图6所示，随着黄芪多糖浓度的增加，对ABTS自由基的清除率逐渐增大。黄芪多糖对ABTS自由基表现出一定的清除能力，IC₅₀为0.813 mg/mL。

Figure 6. Scavenging rate of Astragalus polysaccharides on ABTS free radicals

图6. 黄芪多糖对ABTS自由基的清除率

3.3.3. 羟基自由基清除能力

如图7所示，随着黄芪多糖浓度的提高，其清除羟基自由基的效率也有所提升。黄芪多糖对羟基自由基表现出一定的清除作用，IC₅₀为1.116 mg/mL。

Figure 7. Clearance rate of Astragalus polysaccharide on hydroxyl radical

图7. 黄芪多糖对羟基自由基的清除率

4. 结论

本研究在单因素试验基础上，由正交试验优化后得到的黄芪多糖最佳工艺参数为液料比1:40 g/mL、乙醇浓度40%、提取温度50℃，在此条件下，提取率达到21.13%，优于文献报道的14.18%和19.86% [6] [7]。黄芪多糖对DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基具有一定的清除能力，表现出一定的抗氧化活性，对三种自由基的IC₅₀分别为0.662、0.813和1.116 mg/mL。黄芪多糖表现出作为天然抗氧化剂的应用潜力。

基金项目

2023年贵州省大学生创新创业项目“蒲公英中4-松油醇的制备及其生物活性研究”(202310668214)；

2024年贵州省大学生创新创业训练立项项目“艾叶挥发油提取及抑菌活性研究”(S2024106680568)。

NOTES

^*通讯作者。