响应面法优化超声辅助低共熔溶剂提取荆芥穗总黄酮

Optimization of Ultrasound-Assisted Deep Eutectic Solvent Extraction of Total Flavonoids from Schizonepeta Spike Using Response Surface Methodology

摘要: 为提高荆芥穗总黄酮的提取效率并开发绿色高效的提取工艺，本研究采用超声辅助低共熔溶剂法(UAE-DES)提取荆芥穗总黄酮，并通过响应面法(RSM)对提取工艺进行优化。通过单因素试验筛选出最佳低共熔溶剂为氯化胆碱–草酸，并考察了摩尔比、含水量、液料比和超声时间对提取率的影响。在此基础上，采用Box-Behnken设计建立三因素三水平的响应面模型，以含水量、液料比和超声时间为自变量，总黄酮提取率为响应值。结果表明，各因素对提取率的影响顺序为：超声时间 > 含水量 > 液料比。最优工艺参数为：含水量10%、液料比20 mL/g、超声时间1.0 h，此时总黄酮提取率达2.36%，与模型预测值接近，表明该模型具有良好的预测性和适用性。本研究建立了一种高效、环保的荆芥穗总黄酮提取方法，为其进一步开发利用提供了技术支撑。

Abstract: To improve the extraction efficiency of total flavonoids from Schizonepeta spike and develop a green and efficient extraction process, this study employed ultrasound-assisted deep eutectic solvent extraction (UAE-DES) combined with response surface methodology (RSM) to optimize the extraction process. Through single-factor experiments, the optimal deep eutectic solvent was identified as choline chloride-oxalic acid, and the effects of molar ratio, water content, liquid-to-material ratio, and ultrasonic time on the extraction yield were investigated. Based on these results, a three-factor, three-level Box-Behnken design was established with water content, liquid-to-material ratio, and ultrasonic time as independent variables, and the total flavonoid extraction yield as the response. The results showed that the order of influence of each factor on the extraction yield was: ultrasonic time > water content > liquid-to-material ratio. The optimal parameters were: water content 10%, liquid-to-material ratio 20 mL/g, and ultrasonic time 1.0 h. Under these conditions, the total flavonoid extraction yield reached 2.36%, which was close to the predicted value , indicating that the model had good predictability and applicability. This study establishes an efficient and environmentally friendly method for extracting total flavonoids from Schizonepeta spike, providing technical support for its further development and utilization.

1. 引言

随着人们对天然产物关注度的不断提高，传统中草药的现代化提取与高效利用已成为研究热点。荆芥穗(Schizonepeta tenuifolia Briq.)为唇形科植物的干燥花穗，具有解表散风、透疹消疮等功效，临床上常用于治疗感冒、头痛、麻疹和疮疡初起等疾病。其药理活性广泛，包括抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用。其中，黄酮类化合物是荆芥穗发挥药效的重要物质基础[1]-[4]。

近年来，低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents, DES)作为一种由氢键供体(HBA)和受体(HBD)构成的新型绿色溶剂备受关注。它具有蒸汽压低、热稳定性好、可生物降解、低毒甚至无毒等优点，在天然产物提取中显示出良好的应用潜力[5]。另一方面，超声辅助提取(Ultrasound-Assisted Extraction, UAE)利用超声波产生的空化效应、机械振动和局部高温，可显著增强溶剂对植物细胞的渗透性和目标成分的溶出速率，从而提高提取效率并缩短提取时间[6]。因此，该试验将DES与UAE技术结合，实现高效、环保地提取荆芥穗总黄酮。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 试验仪器

KH-600KDE超声波清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司)、UV-5800紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)、XF-100型粉碎机(东莞市房太电器有限公司)、BS124S电子分析天平(天津市德安特传感技术有限公司)、GL-20G-C台式高速冷冻离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)。

2.1.2. 试验试剂

芦丁标准品(纯度 ≥ 98%)购自上海源叶科技有限公司；荆芥穗树皮由贵州工程应用技术学院天然产物实验室提供；氯化胆碱、1,2-丙二醇、葡萄糖、乙二醇购自上海麦克林；尿素、草酸购自阿拉丁。以上实验药品均为分析纯。

2.2. 方法

2.2.1. 样品预处理

荆芥穗于烘箱烘干后粉碎，过60目筛，保存备用。

2.2.2. 芦丁标准曲线的绘制

参照文献[7]，分别吸取0.2 mg/mL芦丁标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于10 mL容量瓶中，依次加入0.4 mL的5% NaNO₂溶液，0.4 mL的10% Al(NO₃)₃溶液和4 mL的4% NaOH溶液，以上操作均需摇匀并放置6 min后再加入下一种试剂。最后用60%的乙醇溶液定容，10 min后于510 nm处测定吸度A。以吸光度(y)对芦丁标准品浓度值(x)作图，得到标准曲线y = 0.00997x + 0.00683，R² = 0.9993。

2.2.3. 荆芥穗总黄酮提取与测定

称取1.0 g荆芥穗皮粉末于100 mL锥形瓶内，按照设定的液料比加入相应的乙醇溶液，将锥形瓶放至于超声波清洗机内，按照设定的超声功率、提取温度和提取时间提取。提取液经抽滤后收集，在5000 r/min下离心10 min，取上清液备用，即总黄酮提取液。

量取1 mL上清液于25 mL容量瓶，参考1.2.2方法检测其吸光度。代入芦丁标准曲线方程，并计算提取液中总黄酮提取率[8]，公式为：

$总黄酮提取率\left(\%\right)=\frac{CVn}{m}\times 100\%$ (1)

式中：C为溶液质量浓度(μg/mL)；V为供试液体积(mL)；n为稀释倍数；m为荆芥穗粉末质量(g)。

2.2.4. 单因素试验

准确称取荆芥穗粉末1.0 g，按照1.2.3中的方法提取荆芥穗中的总黄酮，分别考察摩尔比(3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3)、含水量(0%, 5%, 10%, 15%, 20%)、液料比(15, 20, 25, 30, 35 mL/g)和超声时间(0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 h)对荆芥穗总黄酮提取率的影响。

2.2.5. 低共熔溶剂的制备与筛选

用氯化胆碱分别与草酸、1,2-丙二醇、葡萄糖、己二醇、尿素按摩尔比1:1、含水量0%混合，放入50 mL的圆底烧瓶中，使用磁力搅拌器在70℃的条件下加热2~3 h，直到形成澄清透明的溶液。制备出5种低共熔溶剂用于荆芥穗总黄酮的提取，如表1。在按照1.2.3的方法对荆芥穗总黄酮进行提取，从而选出提取率最高的低共熔溶剂用于后续工作。

Table 1. Deep eutectic solvent types

表1. 低共熔溶剂类型

类型	HBA	HBD	摩尔比
DES-1	氯化胆碱	1,2-丙二醇	1:1
DES-2		葡萄糖
DES-3		草酸
DES-4		乙二醇
DES-5		尿素

2.2.6. 响应面试验

在单因素试验基础上，选取影响显著的三个因素为自变量：含水量(A)、液料比(B)和超声时间(C)为自变量，以荆芥穗总黄酮提取率为响应值，建立响应面模型。各因素水平设计见表2。

Table 2. Factors and levels of Box-Behnken response surface experimental design

表2. Box-Behnken响应面试验设计因素及水平

水平	含水量 (A)/(%)	液料比 (B)/(mL/g)	超声时间 (C)/(min)
−1	5	15	0.5
0	10	20	1.0
1	15	25	1

3. 结果与分析

3.1. 单因素试验结果

3.1.1. 低共熔溶剂的筛选

图1显示，五种不同的低共熔溶剂对荆芥穗总黄酮的提取效果存在差异，DES-3溶剂的提取率最高，达到1.87%，明显高于其他四种溶剂。DES-1和DES-5的提取率次之，而DES-4和DES-2的提取率则相对较低。因此，选择DES-3作为最优的提取溶剂用于后续提取。

Figure 1. Effect of DES type on the extraction yield of total flavonoids

图1. DES种类对提取对总黄酮提取率的影响

3.1.2. 摩尔比对荆芥穗总黄酮提取率的影响

图2显示，提取率随摩尔比减小显著上升，1:2时达到最大值1.81%。随后继续减小摩尔比，提取率反而下降。这可能是因为，增加HBD占比可以降低DES黏度与表面张力，促进成分扩散，而HBD占比过高会弱化HBA的作用，影响黄酮类化合物与溶剂的相互作用。

Figure 2. Effect of molar ratio on the extraction yield of total flavonoids

图2. 摩尔比对总黄酮提取率的影响

3.1.3. 含水量对荆芥穗总黄酮提取率的影响

图3显示，提取率随含水量增大先增后减，当含水量为10%时，提取率最高，为1.94%。当含水量为10%时，适量水分既可充当质量传递的介质，增强溶剂在物料中的扩散性和渗透性，又能通过水分子与目标成分的极性相互作用促进其溶解和渗出。然而，当含水量过高时，过量的水会过度稀释提取溶剂，降低其溶解效能。

Figure 3. Effect of water content on the extraction yield of total flavonoids

图3. 含水量对总黄酮提取率的影响

3.1.4. 液料比对荆芥穗总黄酮提取率的影响

图4显示，当液料比为20:1时，荆芥穗总黄酮提取率达到最高为2.20%。然而过低液料比会使溶剂黏度增加，阻碍传质；过高液料比则会因过度稀释溶剂，降低其溶解选择性并增加传质阻力，导致提取率显著下降至0.85%。

Figure 4. Effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield of total flavonoids

图4. 液料比对总黄酮提取率的影响

3.1.5. 超声时间对荆芥穗总黄酮提取率的影响

图5显示，提取率随时间的增加先升后降，在1.5 h时达到峰值为1.79%。这可能是因为时间在0.5 h~1.5 h时传质充分，提取率上升；但时间过长时，超声波的高能量会使黄酮类化合物结构降解，从而导致提取率下降至1.42%。

Figure 5. Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids

图5. 超声时间总黄酮提取率的影响

3.2. 响应面优化结果

3.2.1. 响应面回归模型建立与分析

由表3响应面试验结果进行拟合，得到多元二次回归方程：荆芥穗总黄酮提取率Y = 2.30 − 0.0700A − 0.0150B + 0.0875C + 0.005AC − 0.2610A² − 0.3160B² − 0.32510C²。

Table 3. Response surface experimental design and results

表3. 响应面试验设计与结果

试验号	A	B	C	提取率/%
1	5	15	1	1.8
2	15	15	1	1.7
3	5	25	1	1.8
4	15	25	1	1.6
5	5	20	0.5	1.8
6	15	20	0.5	1.6
7	5	20	1.5	1.9
8	15	20	1.5	1.8
9	10	15	0.5	1.7
10	10	25	0.5	1.6
11	10	15	1.5	1.8
12	10	25	1.5	1.8
13	10	20	1	2.3
14	10	20	1	2.3
15	10	20	1	2.3
16	10	20	1	2.3
17	10	20	1	2.4

由表3可知，F_模型 = 105.80，P_模型 < 0.0001，这表明模型的拟合程度极显著，能够相对来说比较准确地反映每个因素与响应值的关系。P_失拟项 = 0.9989 > 0.05无显著性，表明所建立的模型回归显著可靠。R² = 0.9927，$R_{Adj}^2$ = 0.9833，表明荆芥穗总黄酮提取率实际值与预测值的拟合度较好。在该模型中，因素A、C以及A²、B²、C²的影响都极显著(P < 0.01)，其余因素无显著性。根据F值所示，提取率受单因素的影响程度为：C > A > B。

Table 4. Variance analysis results of the regression equation

表4. 回归方程方差分析结果

方差来源	平方和	自由度	均方差	F值	P值
模型	0.0392	9	0.1320	105.80	<0.0001
A	0.0018	1	0.0392	31.43	0.0008
B	0.0613	1	0.0018	1.44	0.2687
C	0.0000	1	0.0613	49.11	0.0002
AB	0.0001	1	0.0000	0.0000	1.0000
AC	0.0000	1	0.0001	0.0802	0.7852
BC	0.2868	1	0.0000	0.0000	1.0000
A²	0.4204	1	0.2868	229.99	<0.0001
B²	0.2653	1	0.4204	337.13	<0.0001
C²	0.0087	1	0.2653	212.70	<0.0001
残差	0.0000	7	0.0012
失拟项	0.0087	3	0.0000	0.0077	0.9989
纯误差	1.20	4	0.0022
总误差	0.0392	16
R^2 = 0.9927
$R_{Adj}^2$ =0.9833
$R_{Pred}^2$ = 0.9880

注：P < 0.05表示影响显著；P < 0.01表示影响极显著。

3.2.2. 各因素相互作用对荆芥穗总黄酮提取率的影响

响应面斜率越陡峭或等高线图形越椭圆，表明两个因素之间的交互作用越明显[9] [10]。图6(a)、图6(b)、图6(c)显示，虽然AB、AC、BC响应曲面陡峭，但等高线图却趋近于圆，因此含水量与液料比、超声时间与含水量、料液比与超声时间的交互作用不显著。这与表4中的结果一致。

(a) 含水量和液料比对荆芥穗总黄酮提取率的影响

(b) 含水量和超声时间对荆芥穗总黄酮提取率的影响

(c) 液料比和超声时间对荆芥穗总黄酮提取率的影响

Figure 6. Interaction effects of various factors on the extraction yield of total flavonoids from Schizonepeta spike

图6. 各因素交互作用对荆芥穗总黄酮提取率的影响

3.3. 最佳工艺参数验证

按照最优模型，当含水量为9.34%、液料比为19.88 mL/g、超声时间为1.09 h可以得到最佳的提取率，提取率预测值为2.3%。结合实际操作的可行性和便捷性，对提取的最佳工艺进行了调整，具体操作如下：含水量为10%、液料比为20 mL/g、超声时间为1.0 h。使用此优化工艺进行验证实验，平行测定3次，结果显示提取率平均分为2.36%，实际结果与预测值非常接近，从而充分证实了该模型的准确与可靠。

4. 结论

本研究成功将低共熔溶剂与超声辅助提取技术相结合，用于荆芥穗总黄酮的高效提取。通过单因素试验确定氯化胆碱–草酸为最佳提取溶剂，并初步确定了各因素的适宜范围。响应面优化结果表明，超声时间、含水量和液料比对提取率有显著影响，其中超声时间影响最大。最终确定的最佳工艺条件为：含水量10%、液料比20 mL/g、超声时间1.0 h，在此条件下总黄酮提取率可达2.36%，显著高于传统方法。该工艺具有提取效率高、操作简便、环境友好等优点，为荆芥穗总黄酮的工业化提取与应用提供了可靠的技术依据，同时也为其他天然产物绿色提取提供了参考。

基金项目

2023年贵州省大学生创新创业项目“侧柏叶精油抗菌软膏的研发”(202310668056)。

2024年贵州省大学生创新创业训练立项项目“杜仲皮总黄酮提取工艺及其生物活性研究(S2024106680597)。

NOTES

^*通讯作者。