罗汉果性别决定机制的分析

The Analysis of the Sex Determination Mechanism in Monk Fruit

摘要: 罗汉果(Siraitia grosvenorii)，作为中国广西的特色经济物种，不仅具有很高的药用价值，还富含高甜味且零热量的天然甜苷成分。罗汉果属于葫芦科雌雄异株的植物，其性别在苗期难以鉴别。DNA分子标记是个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，DNA分子标记技术为罗汉果雌雄的有效鉴定提供了手段。本文收集了已报道罗汉果中与性别相关的DNA分子标记，并将这些DNA分子标记定位到了基因组的重叠群和可能的基因上。此外，我们还对这些基因进行了同源比对分析，预测了其可能的编码产物，这为研究罗汉果性别决定机制提供了重要的研究基础。

Abstract: Monk fruit (Siraitia grosvenorii), a characteristic economic species of Guangxi, China, not only possesses substantial medicinal value but is also rich in high-intensity, zero-calorie natural sweet glycosides (mogrosides). As a dioecious member of the Cucurbitaceae, monk fruit exhibits sexes that are difficult to distinguish at the seedling stage. DNA molecular markers—genetic markers based on nucleotide sequence variation among individuals—provide an approach for reliable sex identification in this species. In the present study, we collected previously reported DNA molecular markers associated with sex in monk fruit and mapped these markers to genomic contigs and candidate genes. We further performed homology-based comparative analyses of these genes and predicted their putative protein products, thereby providing an important foundation for future research into the sex-determination mechanism of monk fruit.

1. 引言

罗汉果俗称“神仙果”，属于葫芦科多年生藤本植物，主产于桂林的永福县、临桂县和龙胜各族自治县，是广西桂林的著名特产[1] [2]。罗汉果在中国传统医学中占据举足轻重的地位，其药用价值广受人民群众认可，历史悠久，它可以用来治疗诸如肺部充血、感冒、喉咙痛等多种疾病[3]。罗汉果的独特之处不仅体现在药用价值上，更在于其含有的多种葫芦烷型三萜甙类罗汉果甜苷成分。其中，罗汉果甜苷是罗汉果高甜度的关键因素，其甜度约为蔗糖的300倍，而且几乎不含热量，这使得罗汉果成了一种理想的甜味剂[4]。现代医药研究也表明，成熟罗汉果提取物，特别是罗汉果甜苷，具有抗肿瘤、抗糖尿病、抗炎和抗氧化等多种生物活性，这为罗汉果的健康价值提供了科学依据[5]。随着世界致力于人类健康的改善，食品和饮料行业对天然、高效、低热量或零热量的甜味剂巨大的需求已经超过传统膳食甜味剂，而罗汉果已经成为仅次于甜叶菊的第二大天然甜味剂来源[6]。因此，罗汉果具有极高的应用价值和市场开发前景。

在现阶段，由于缺乏相关的科学研究、农艺经验和优质种质资源，再加上罗汉果植物对环境的适应性差等因素，罗汉果的市场供应还非常有限[6]。此外，罗汉果为雌雄异株的植物，须进行人工授粉才能结实[7]。然而，罗汉果幼苗阶段性别难以仅凭形态特征鉴别，因此，通过鉴定其DNA水平差异成为鉴别性别的最可靠手段。本文收集了多个已报道的罗汉果性别连锁的DNA分子标记，并对这些分子标记的序列进行了基因组定位分析，找到了这个分子标记所在的基因或附近基因，并对这些基因的序列进行了同源比对分析，这为研究罗汉果性别决定机制提供了重要的研究基础。

2. 材料与方法

本研究使用的罗汉果(Siraitia grosvenorii)基因组与注释数据来源于公共数据库NCBI (Bioproject PRJNA339375)。本研究采用TBTools (https://github.com/CJ-Chen/TBTools)作为核心分析平台，整合其内置工具完成全基因组共线性比对及核心基因家族多序列比对，使用TBTools的系统发育树构建插件(调用RAxML-HPC2 v8.2.12)构建最大似然树(ML)树，参数设置与原流程一致。

3. 结果分析

3.1. DNA分子标记分类

DNA分子标记基于个体间遗传物质内核苷酸序列的变异，直接反映了DNA水平的遗传多态性。利用一些分子标记技术，如表1所示：限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP)，扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)，随机扩增多态DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)，测序的扩增区段(Sequence Characterized Amplified Region, SCAR)等[8]-[11]。

Table 1. Comparison of molecular markers: RFLP, AFLP, RAPD, and SCAR

表1. RFLP、AFLP、RAPD和SCAR分子标记的比较

分子标记 参数	RFLP	AFLP	RAPD	SCAR
标记产物的质量	低质量、高特异性	高质量、高特异性	高质量、无特异性	低质量、高特异性
重现性	高	高	低	高
检测精度	高	高	高	低
操作和开发难易程度	难	中	易	易
流程时间	长	短	短	短
是否使用放射性	是	是/否	否	否
检测类型	酶切产物	DNA扩增	DNA扩增	DNA扩增
重复成本	高	高	低	低
可信度	高	高	低	高
检测位点	单位点	多位点	多位点	单位点
检测基因组范围	通常为低拷贝区	全基因组	全基因组	局部
专业技术需求	高	高	低	低
模板基因组质量	高	高	中等以上	中等以上
是否依赖PCR	No	是	是	是

RFLP是第一种DNA分子标记技术，其最早用于构建人类基因组的第一个分子图谱[12]。RFLP技术通过识别并区分不同来源基因组DNA在限制性酶消化后产生的不同长度DNA片段，从而确定不同的基因型。RFLP的缺点是其需要大量的DNA (5~20 ug)，且很难区分基因型相近的物种，检测中要利用放射性同位素，易造成污染，灵敏度较低等。

AFLP是RFLP技术与PCR技术相结合的方法，其是通过限制性内切酶(一种稀有位点切割酶和一种高频位点割酶)对基因组DNA切割产生不同大小的DNA片段，再对这些DNA片段添加合成的接头序列，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的3'端添加1~3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增，通过电泳分离检测分析的扩增产物的多态性[13]。AFLP技术的优势显著，包括能检测大量多态性、无需预知DNA序列信息、对基因组模板浓度变化不敏感、结果重现性高，以及能快速生成丰富的多态性片段。这使得AFLP在研究动物、植物和微生物物种的种群遗传学和遗传多样性中成为一种非常流行的分子标记技术。尽管如此，由于AFLP方法需要通过银染、荧光或放射性检测，并在大型测序凝胶或自动DNA测序仪上解析，这导致该方法的成本非常高且需要熟练的技术人员才能完成[9]。

RAPD是一种基于PCR技术被广泛用于鉴定基因型的方法，其是利用随机引物(通常为10碱基)对基因组DNA进行PCR扩增，通过比较产物的多态性来确定物种的关系和基因型[14]。RAPD仅需要少量的DNA且在数小时内就可以操作完成；但是RAPD的重现性较差，不同的试剂和不同的实验条件均可导致实验结果发生变化[9] [15]。

SCAR是在RAPD的基础上发展出来的，其是使用更长的特异性引物(15~30 bp)扩增RAPD多态性片段，这使得SCAR不会面临RAPD通常遇到的低重现性问题[9] [16]。SCAR已被证明在特定种内和/或种间水平的植物鉴定时，具有更高重现性且更可靠的特性。此外，SCAR不需要放射性同位素，且仅检测单个位点，具有高度重现性和位点特异性，可应用于标记辅助选择各种作物的农业经济性状[9]。

AFLP、RAPD和SCAR都可以用来检测雌雄罗汉果DNA水平的差异，从而实现对罗汉果雌雄的鉴别。早期，陶莉等通过AFLP标记技术快速地鉴别罗汉果幼苗雌雄株[17]；也有不同的研究学者通过RAPD发现了罗汉果性别连锁的分子标记[18]-[20]；随后，多个SCAR标记被开发用于罗汉果雌雄鉴定[21]-[24]。

3.2. 罗汉果性别连锁的分子标记

罗汉果性别连锁的分子标记是区分罗汉果性别的有力证据，目前已有多个不同类型的与罗汉果性别相关的分子标记被报道。在2005年，陶莉等利用AFLP标记技术，结合数量性状分析，建立了一种罗汉果幼苗雌雄鉴别的方法[17]；同年，韦弟等利用RAPD技术鉴定到了与雄性连锁的分子标记[18]。紧接着，在2006年，黄夕洋等同样用RAPD技术获得了五个可用于罗汉果栽培品种性别鉴定分子标记[19]。随后，在2007年黄姿梅等也用RAPD技术在不同的罗汉果品种中鉴定到了多个与性别相关的分子标记[20]。近些年，多个与罗汉果性别相关的SCAR标记的专利被公开报道，如张会新[21]，莫长明等[22]，刘晓林等[23]分别申请了不同的SCAR分子标记专利；谢文娟等也在2019年报道了两个罗汉果雄性特异性的SCAR分子标记[24]。我们搜集并整理了已公开的罗汉果性别连锁分子标记序列，依据报道顺序命名编号，如表2，共获得1个AFLP，3个RAPD和5个SCAR标记序列。

Table 2. Sex-linked molecular markers in monk fruit

表2. 罗汉果性别相关的分子标记

分子标记类型	报道时间	分子标记序列	参考文献	命名序号
AFLP	2005	未知	陶莉等[17]	无
RAPD	2005	未知	韦弟等[18]	无
RAPD	2006	未知	黄夕洋等[19]	无
RAPD	2007	公开	黄姿梅等[20]	RAPD 1、RAPD 2、RAPD 3
SCAR	2013	公开	张会新等[21]	SCAR 1
SCAR	2018	公开	莫长明等[22]	SCAR 2
SCAR	2018	公开	刘晓林等[23]	SCAR 3
SCAR	2019	公开	谢文娟等[24]	SCAR 4、SCAR 5

3.3. 罗汉果性别连锁的分子标记在基因组中的位置信息

DNA是遗传物质的基础，DNA序列的差异可直接决定生物性状的差异。罗汉果性别连锁的分子标记的多态性，可能是决定罗汉果雌雄差异的根本原因。因此，我们对收集到的罗汉果性别连锁的分子标记所在的基因组位置信息进行了分析。罗汉果的全基因组测序与组装已经在前几年完成了[25]，通过与组装后的罗汉果基因组比对后，我们成功将这些分子标记定位到了对应的重叠群(Contigs)。比对定位的结果显示，这些分子标记分布在不同的重叠群上，如图1所示，RAPD 1、RAPD 2和RAPD 3分别定位在tig00008975、tig00153277和tig00005661上；SCAR 1、SCAR 2、SCAR 3、SCAR 4、SCAR 5分别定位在tig00005074、tig00153490、tig00008110、tig00009290和tig00001804上。

Figure 1. Contigs corresponding to sex-linked molecular markers in monk fruit

图1. 罗汉果性别分子标记对应的重叠群

3.4. 罗汉果性别连锁的分子标记对应的编码基因信息

为了进一步分析这些分子标记的信息，我们进一步对这些分子标记的位置信息进行了更精准的定位。序列比对后，我们精确定位了这些分子标记至其对应基因或其邻近区域。结果如图2所示，RADP 2、RAPD 3、SCAR 1和SCAR 4都定位在预测的编码序列之外，其中SCAR 1非常靠近evm.TU.tig00005074.5；而RAPD 1、SCAR 2、SCAR 3和SCAR 5分别定位在evm.TU.tig00008975.2、evm.TU.tig00153490.15、evm.TU.tig00008110.8和evm.TU.tig00001804.1上，接着我们对这几个分子标记进行了进一步的分析研究。

3.5. 罗汉果性别连锁的分子标记对应基因的序列分析

为了进一步研究罗汉果性别连锁的分子标记，我们将RAPD1、SCAR2、SCAR3和SCAR5所在的evm.TU.tig00008975.2、evm.TU.tig00153490.15、evm.TU.tig00008110.8和evm.TU.tig00001804.1的蛋白序列分别进行了BLAST比对。结果如图3所示，evm.TU.tig00008975.2 (RAPD1)可能编码的是支链氨基酸氨基转移酶(Branched Chain Amino Acid Aminotransferase)；evm.TU.tig00153490.15 (SCAR2)则可能编码了

Figure 2. Genes corresponding to sex-linked molecular markers in monk fruit

图2. 罗汉果性别分子标记对应的基因

一个1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate Synthase)，该酶在植物激素乙烯的合成中发挥了重要作用；evm.TU.tig00008110.8 (SCAR3)则可能编码的是富亮氨酸重复受体样蛋白激酶(Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Protein Kinase)，这类激酶在介导细胞的信号传导中发挥了非常重要的作用；evm.TU.tig00001804.1 (SCAR5)则可能编码的是一个谷氨酸受体，有研究表明谷氨酸受体与植物的有性生殖相关，尤其是在花粉的发育过程中。

4. 讨论与展望

罗汉果是广西特色经济植物，具有巨大的药用和食用价值；然而，目前关于罗汉果的研究还远远落后于其他植物经济作物。本文收集了不同的罗汉果性别相关的分子标记并进行了序列分析，拟对罗汉果的性别决定机制进行探讨。分析8个罗汉果性别相关分子标记后，我们发现RAPD 1、SCAR 2、SCAR 3及SCAR 5位于不同编码基因内；这些编码基因的预测产物依次为支链氨基酸氨基转移酶、1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶、富亮氨酸重复受体样蛋白激酶及谷氨酸受体。在罗汉果的近亲植物黄瓜和甜瓜中，乙烯已经被证实和植物的性别决定有重要的联系[26]。前人的研究已经表明1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶是植物激素乙烯的重要合成酶[27] [28]，而evm.TU.tig00153490.15编码的蛋白也被前面命名为ACS2 (ACC Synthase 2)，因此ACS2在罗汉果的雌花形成中也可能发挥了重要作用。在拟南芥和水稻中，富亮氨酸重复受体样蛋白激酶已被证实和雄花的花药细胞形成和小孢子母细胞的发生有关[29]。在拟南芥和烟草中，谷氨酸受体可以通过调控钙离子内流和振荡影响花粉管的发育[30]。然而，支链氨基酸氨基转移酶是否也与植物的有性生殖相关还需进一步研究。虽然RAPD2、RAPD3和SCAR1并没有定位到编码基因的区域，但是它们可能通过非编码RNA等调控的形式影响了性别相关的基因表达，从而导致雌雄株的差异。

Figure 3. Encoded products of genes corresponding to sex-linked molecular markers in monk fruit

图3. 罗汉果性别分子标记对应的基因的编码产物

葫芦科中存在大量雌雄异株的物种，是研究植物性别分化的良好模型，很多相关工作已经在甜瓜和黄瓜中展开。在甜瓜中，雌雄同株为野生型，雌雄同株andromonoecious (M)、全雄株androecious (A)和全雌株gynoecious (G)基因分别编码CmACS-7、CmACS11和CmWIP1 [27] [28] [31]。CmWIP1编码的是一个C2H2锌指型转录因子，其表达导致心皮发育失败，从而产生雄花；而当CmWIP1的表达受到表观修饰抑制时，可以产生全雌植株。近期的研究表明，CmWIP1是通过招募共抑制子TOPLESS到心皮身份基因CRC (CRABS CLAW)的启动子上进行组蛋白去乙酰化从而抑制了CRC的表达；相反，破坏TOPLESS-CmWIP1的蛋白互作会导致CRC的表达和心皮的发育，随后又导致雄蕊抑制基因CmACS7的表达，最终导致雌花发育[32]。葫芦科中与性别相关的基因都是高度同源和保守的，因此寻找罗汉果中WIP1基因也有利于对罗汉果性别分子机制的揭示。

目前在罗汉果中报道的性别相关的分子标记主要为RAPD和SCAR标记，然而RAPD与SCAR标记在植物雌雄鉴定中存在多重局限：RAPD为显性标记，无法区分杂合体，遗传分析精度受限；其重复性差，易受实验条件(如引物、温度)影响，且存在共迁移问题，可能误判条带；需大量引物筛选，效率较低。SCAR标记虽通过克隆测序提升稳定性，但依赖初始RAPD标记的准确性，若关联性弱则失效；开发成本高，步骤复杂；可能因基因组重复序列导致非特异性扩增，且适用范围常限于特定品种。两者共同受限于性别决定机制的复杂性(如多基因或环境调控)，需结合表型观察；对DNA质量要求高，实验条件敏感(如退火温度)。

然而，其它分子标记如简单重复序列(SSR, Simple Sequence Repeat)和单核苷酸多态性(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)等标记在罗汉果的雌雄鉴定中还未见报道。SSR的优点在于其所需DNA样品量少，对基因组DNA质量要求不苛刻、可靠性高、重复性好、多态性丰富等；SNP的优点在于其数量多、分布广泛、稳定性高、共显性、适于快速和规模化筛查。罗汉果的全基因组测序和组装已经完成，这为今后SSR和SNP标记的开发提供了有利的条件。未来可结合SSR、SNP等共显性标记或高通量测序技术，优化实验流程并验证标记特异性，以提升鉴定可靠性。

NOTES

^*通讯作者。