1. 引言
氰化物是指氰基作为特征官能团的一类化合物，根据其化学结构可分为无机氰化物、有机氰腈类化合物及金属氰络合物三大类。其毒性作用机制源于氰离子与细胞色素C氧化酶的三价铁活性中心发生不可逆结合，通过阻断线粒体呼吸链的电子传递，抑制细胞氧代谢过程，导致组织细胞缺氧性损伤。当暴露剂量超过半数致死量时，可在数分钟内引发急性缺氧性窒息，具有致命风险[1] [2]。
值得关注的是，近年食品安全监测数据显示，非法使用氰化物毒杀犬类动物的事件呈现地域性频发态势。涉案毒物主要为俗称“山奈”的剧毒无机盐氰化钠与氰化钾，二者因具有速效致死特性，常被不法分子用于违法捕杀犬只[3]。经食物链传递后，残留氰化物可对人体中枢神经系统及心血管系统造成不可逆损伤，此类食品安全问题亟待加强源头监管与检测技术开发。
氰化物的分析检测技术体系主要涵盖分光光度法、流动注射分析法、电化学传感法、容量滴定法、气相色谱–质谱联用法以及高效液相色谱法等[4]。如表1所示，分光光度法与流动注射分析法虽在水体、酒类等均质液体基质中表现良好，但在处理复杂生物基质时易受共馏物干扰，导致定量准确性下降及特征吸收峰特异性不足[5] [6]；容量滴定法则仅限于氰化物含量高的样品检测；电化学传感器虽具快速响应优势，但其检测重现性难以满足痕量分析要求；气相色谱–质谱联用法通常需结合顶空进样技术，受顶空富集效率限制及色谱柱耐受温度影响，方法灵敏度难以突破[7]-[11]。相较而言，柱前衍生–高效液相色谱技术通过特异性衍生反应可有效提升检测灵敏度，同时兼具优良的色谱峰分离度，在复杂基质检测中展现出显著优势[12]。
值得注意的是，目前我国尚未颁布针对肉类食品中氰化物的标准化检测方法。本研究创新性地构建了基于异烟酸–吡唑啉酮柱前衍生的液相色谱检测体系：首先采用凯氏蒸馏装置在酸性条件下将样品中氰化物转化为挥发性氢氰酸，经2%氢氧化钠溶液吸收后形成稳定氰化钠溶液；随后在中性缓冲体系中，氰化物与氯胺T反应生成活性中间体氯化氰，该产物与异烟酸–吡唑啉酮衍生试剂发生缩合反应，生成具有特征紫外吸收的蓝色双偶氮化合物，最后通过反相色谱柱实现衍生物的高效分离与准确定量。
方法验证实验表明：该体系在0.02~110 mg/kg线性范围内相关系数r2 > 0.999，精密度RSD < 5% (n = 6)，加标回收率达95.3%~98.3%，方法检出限为0.02 mg/kg，较传统分光光度法提升约10倍灵敏度。本方法成功解决了肉类基质中蛋白质、脂肪等干扰物对检测信号的抑制问题，为肉制品中痕量氰化物的精准检测及未来国家标准的制定提供了可靠的技术参考。
Table 1. Comparative study on methods for cyanide determination
表1. 氰化物的测定方法比对
性能参数 |
本研究方法 |
GB 5009.36-2023
分光光度法 |
气相色谱–质谱联用法 |
检出限(mg/kg) |
0.02 |
0.30 |
0.0002 |
线性范围(mg/kg) |
0.02~110 |
0.03~20 |
0.004~0.08 |
回收率(%) |
95.3~98.3 |
90~110 |
99.10~103.4 |
分析时间 |
样品前处理较长，
但自动化程度高 |
样品前处理繁琐，
整体耗时较长 |
前处理分析时间较长 |
抗干扰能力 |
强，色谱分离与特异性衍生有效分离共馏物 |
弱，复杂生物基质中
特征吸收峰特异性不足，
易受干扰 |
中等，色谱分离有助于抗干扰，但顶空进样可能引入新的基质效应 |
方法重现性 |
高，衍生化反应稳定 |
在复杂基质中重现性较差 |
重现性一般，受仪器状态、顶空平衡一致性等多因素
影响 |
适用基质复杂度 |
高，适合肉类等复杂
生物基质 |
适用于木薯粉、蒸馏酒、
饮用水等均质基质 |
适用于蒸馏酒、饮用水等
均质液体基质 |
2. 材料与方法
2.1. 主要仪器与试剂
实验仪器：K-355型半自动凯氏定氮蒸馏装置(BÜCHI Labortechnik AG，瑞士)；1260 Infinity II型高效液相色谱系统(Agilent Technologies Inc.，美国)，配置二元泵、自动进样器及二极管阵列检测器。
试剂与标准品：氰化物标准储备液(50 mg/L, BW20005-50-20，批号B23060321，坛墨质检科技股份有限公司)，4℃避光保存；甲醇(色谱纯，Fisher Chemical，美国)；氯胺-T (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；异烟酸(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(分析纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；酒石酸、氢氧化钠、乙酸锌、酚酞指示剂、冰乙酸、乙酸铵(均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；实验用水由Milli-Q超纯水系统制备。
实验样品：1) 市售样品组：采集自本地农贸市场及餐饮零售终端的猪肉、鸭肉及狗肉样本(n = 15)；2) 监督抽检组：来源于市场监管部门专项抽检的疑似污染肉类样本(n = 6)，所有样品均于−20℃冷链保存至前处理阶段。
2.2. 方法
2.2.1. 色谱条件优化
色谱系统采用Diamonsil® Silversil C18反相色谱柱(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)或等效色谱柱。流动相体系为二元梯度系统：A相为0.02 mol/L乙酸铵缓冲溶液(pH 6.8)，B相为色谱纯甲醇，按A:B = 65:35 (v/v)比例进行等度洗脱。检测器波长优化为638 nm (对应衍生物最大吸收波长)，柱温箱设定为25℃ ± 0.5℃，流速1.0 mL/min，进样体积20 μL。系统平衡时间 ≥ 30 min，基线漂移 < 0.5 mAU/h。
2.2.2. 溶液标准化制备
乙酸铵缓冲液(0.02 mol/L)：准确称取1.54 g乙酸铵(溶于适量超纯水，超声脱气10 min后定容至1.0 L，经0.22 μm尼龙滤膜过滤。
磷酸盐缓冲液(pH 7.0)：精密称取无水磷酸氢二钾(34.0 g)与磷酸氢二钠(35.5 g)，溶解后定容至1.0 L，使用pH计校准。
异烟酸–吡唑啉酮衍生液：组分A：称取1.5 g异烟酸溶于24 mL氢氧化钠溶液(20 g/L)，涡旋振荡溶解后定容至100 mL；组分B：称取0.25 g 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮溶于20 mL无水乙醇，超声辅助溶解；临用前将A、B液按1:1混合，避光保存(有效期 ≤ 4 h)。
乙酸锌沉淀剂(100 g/L)：称取10.0 g乙酸锌[溶于超纯水，定容至100 mL；
氯胺T氧化剂(10 g/L)：现用现配，称取1.0 g氯胺T(溶于超纯水，避光保存(有效期 ≤ 2 h)；
酒石酸水解液(200 g/L)：称取20.0 g酒石酸溶于超纯水，定容至100 mL；
氢氧化钠(20 g/L)：称取2.0 g氢氧化钠定容至100 mL；
氢氧化钠工作液(2 g/L)：取10.0 mL氢氧化钠(20 g/L)定容至100 mL。
2.2.3. 样品前处理标准化流程
肉类样品提取：精密称取均质化肉样5.00 ± 0.01 g，定量转移至500 mL凯氏消化管，加入200 mL超纯水，磁力搅拌(800 rpm, 30℃) 2~4 h实现氰化物充分溶出。依次加入20 mL乙酸锌溶液(100 g/L)及2.0 g酒石酸，立即连接凯氏蒸馏装置，冷凝管出口浸入含5 mL氢氧化钠吸收液(20 g/L)的100 mL容量瓶。控制蒸汽流量2.0 L/min，收集馏出液至95 mL时停止，超纯水定容至标线。精密移取10.0 mL馏出液至25 mL具塞比色管，作为待衍生试样。
标准曲线构建：精密移取4.00 mL氰化物标准储备液(50.0 mg/L)，用氢氧化钠溶液(2 g/L)定容至100 mL，获得2.0 mg/L中间液。分别移取0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL中间液至25 mL比色管，补加氢氧化钠溶液(2 g/L)至10.0 mL，形成0、0.10、0.20、0.40、1.00、2.00、4.00 μg/mL标准系列。
质量控制体系：空白基质液：选取经气相色谱–质谱连用法验证无氰化物残留的阴性肉样5.00 g，同步进行提取；
加标回收液：向阴性基质中加入50.0 μL氰化物标准储备液(50.0 mg/L)，使加标浓度为0.50 mg/kg，平行制备3份。
方法学注释：所有溶液均现用现配，实验器皿经10%硝酸浸泡24 h后以超纯水冲洗。衍生反应在恒温水浴锅(30℃ ± 1℃)中进行，避光操作。液相色谱进样前经0.22 μm PVDF滤膜过滤，避免柱压异常。
2.2.4. 衍生化反应与色谱分析
取10.0 mL试样溶液或标准系列溶液于25 mL具塞比色管中，按以下程序进行衍生化反应：
1) pH调节：精密加入1滴酚酞–乙醇指示剂(1%)，逐滴加入乙酸溶液(1:24)至溶液由粉红色完全褪去(pH 6.8~7.2，采用精密pH试纸验证)；
2) 缓冲体系构建：准确加入5.0 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0，预恒温至30℃)，涡旋混匀10 s；
3) 氧化反应：将比色管置30℃ ± 1℃恒温水浴中预热10 min，精密加入0.50 mL新制氯胺T溶液(10 g/L)，立即密封涡旋混合30 s，避光静置5.0 min (计时误差 ≤ 5 s)；
4) 显色衍生：快速加入4.0 mL异烟酸–吡唑啉酮衍生混合液(现配 ≤ 30 min)，补加超纯水至25.0 mL标线，涡旋震荡1 min混匀；
5) 显色强化：转移至30℃ ± 1℃恒温水浴中避光反应40.0 min，期间每10 min手动振摇10次以确保反应完全；
6) 样品测定：反应液经0.22 μm PVDF滤膜过滤，弃去初滤液2 mL，收集续滤液至2 mL棕色进样瓶，立即进行高效液相色谱法分析。以峰面积外标法计算含量。
3. 结果与分析
3.1. 方法学研究
3.1.1. 流动相体系筛选与优化
为优化氰化物衍生物的色谱分离效能，本研究系统考察了水–甲醇、水–乙腈、0.02 mol/L乙酸铵–甲醇及0.02 mol/L乙酸铵–乙腈四种流动相体系对目标物的保留行为影响。实验表明：纯有机相体系(水–甲醇/乙腈)中，衍生物峰形拖尾严重(对称因子 > 1.8)，且保留时间波动显著；而乙酸铵缓冲液–有机相体系通过离子对作用可显著改善分离选择性。进一步优化配比发现，当乙酸铵–甲醇比例为65:35时，氰化物衍生物保留时间稳定在6.2 ± 0.2 min，显著优于其他配比条件。
3.1.2. 检测波长优化
通过紫外–可见吸收光谱扫描(300~700 nm)发现，氰化物衍生物在638 nm处呈现特征性吸收峰，其摩尔吸光系数显著高于邻近波段，选择638 nm作为检测波长时，信噪比较600 nm提升，且基线噪声水平可满足检测需求。
3.1.3. 衍生化反应动力学研究
通过单因素实验探究温度(20℃~50℃)与时间(10~60 min)对衍生效率的影响。如图1结果表明当反应温度 < 30℃时，反应速率常数k随温度升高显著增大；当温度 > 30℃时，因副反应加剧，峰面积下降。30℃条件下，反应40 min后峰面积趋于平台，表明反应完全。选定条件(30℃, 40 min)下连续6次测定RSD = 1.8%，证实方法稳定性。
Figure 1. Effect of derivatization time and temperature on peak area
图1. 衍生时间和衍生温度对峰面积的影响
3.1.4. 异烟酸–吡唑啉酮衍生剂用量优化
精密移取1.00 mL氰化物标准中间液(2.0 μg/mL)至25 mL具塞比色管中，补加超纯水至10.0 mL标线，按2.2.3节方法进行衍生化反应。系统考察异烟酸–吡唑啉酮衍生剂添加量(1.0~5.0 mL，梯度间隔1.0 mL)对显色强度的影响，每组实验平行测定3次。如图2所示，当衍生剂用量从1.0 mL增至4.0 mL时，目标物峰面积呈线性增长趋势。当衍生剂用量 ≥ 4.0 mL时，峰面积达到平台值，相对标准偏差(RSD) < 1.5% (n = 3)，表明此时衍生反应达到化学平衡。基于此，选择4.0 mL作为最佳衍生剂添加量，既可确保反应完全性，又可避免过量试剂造成的色谱基线干扰。
Figure 2. Effect of derivatization dose on peak area
图2. 衍生剂量对峰面积的影响
3.1.5. 衍生产物稳定性与进样时效性研究
取衍生化反应完成的试样溶液(按2.2.3节方法制备)，于25 mL具塞棕色玻璃比色管(避光保存)中，在25℃ ± 1℃条件下进行时程稳定性考察。以初始时间点(t = 0 h)为基准，每隔1.0 h精密进样20 μL (n = 3)，记录氰化物衍生物色谱峰面积变化。实验数据显示：0~8 h内目标物峰面积衰减率为(4.2 ± 0.8)% (RSD = 1.8%, n = 24)，满足定量分析要求。当储存时间 > 8 h时，峰面积显著下降(12 h衰减率 > 9%)。因此，建议衍生化反应完成后需在8 h内完成HPLC进样分析，并全程采用棕色进样瓶避光保存。
Figure 3. Effect of injection time on peak area
图3. 进样时间对峰面积的影响
3.2. 方法学验证
3.2.1. 方法特异性评估
为验证方法抗基质干扰能力，分别对空白基质溶液(阴性肉样提取液)、氰化物标准溶液及加标样品溶液进行HPLC分析。如图4所示：
1) 空白基质溶液在氰化物衍生物保留时间窗口(6.2 ± 0.2 min)内未检测到显著干扰峰。
2) 标准溶液色谱图呈现单一尖锐目标峰。
3) 加标样品溶液目标峰保留时间与标准品偏差 < 0.5%，且未出现共洗脱峰，符合对分析方法特异性的要求。
(a) 空白样品色谱图
(b) 标准溶液色谱图 (c) 加标样品溶液色谱图
Figure 4. HPLC Chromatogram
图4. 色谱图
3.2.2. 线性范围与灵敏度验证
采用7点校准曲线(0.02, 0.10, 0.50, 1.00, 10.00, 50.00, 110.00 mg/kg)评估方法线性。以氰化物浓度为自变量，对应色谱峰面积为因变量，拟合得线性回归方程：y = 5.04748x − 1.31885，r2 = 0.99996。残差分析显示，各浓度点残差绝对值均 < 1.5%，满足检测需求。方法灵敏度参数：检出限为0.02 mg/kg，定量限为0.06 mg/kg，符合AOAC对食品污染物检测方法的性能要求。
3.2.3. 精密度评价
精密度：取中浓度标准溶液(10.0 mg/kg)连续进样6次，测得色谱峰面积分别为565.303、564.239、565.001、563.980、565.287、564.762 (mAU)，相对标准偏差(RSD)为0.13%。
3.2.4. 加标回收率验证
本研究选取猪肉、鸭肉和狗肉三种不同基质样本作为研究对象，采用加标回收实验对方法准确性进行验证。实验设计三个浓度梯度(1, 2, 5 mg/kg)，每个浓度水平平行制备3份样品，按照本文建立的样品前处理方法和HPLC分析条件进行测定。如表2实验结果表明：1) 方法准确性方面，三种基质在1~5 mg/kg加标浓度范围内的平均回收率为95.3%~98.3% (如表2所示)，均满足分析方法对回收率(95%~105%)的基本要求；2) 方法精密度方面，各浓度水平测定结果的相对标准偏差(RSD)为0.18%~2.58% (n = 3)，均低于5%，表明该方法具有良好的重复性。上述结果证明，本研究所建立的分析方法对不同动物源性食品基质均具有较好的适用性，能够满足氰化物残留检测的准确性和精密度要求。
Table 2. Recovery and precision
表2. 回收率和精密度
样品 |
1 mg/kg |
RSD% |
2 mg/kg |
RSD% |
5 mg/kg |
RSD% |
猪肉 |
96.3 |
1.65 |
96.1 |
0.18 |
96.9 |
0.49 |
鸭肉 |
98.3 |
0.75 |
96.8 |
2.58 |
95.5 |
1.46 |
狗肉 |
95.8 |
0.73 |
95.3 |
0.34 |
95.8 |
0.97 |
3.2.5. 实际样品的检测
本研究针对市场监管中发现的食品安全风险隐患，对市售可疑肉类样品开展氰化物污染专项检测。实验随机抽取40批次高风险样本(包括鸭肉20批次、狗肉20批次)，采用高效液相色谱法进行氰化物残留检测。检测结果显示：鸭肉样品中未检出氰化物阳性，狗肉样品中检出1批次氰化物阳性，含量为9.98 mg/kg，检出率达5%。结果表明，市售可疑狗肉样品中存在剧毒氰化物的现象，需加强此方面的监督管理。
4. 结果与讨论
本方法基于氰化物的挥发性与特异性衍生反应，构建了“蒸馏提取–氧化衍生–色谱定量”三位一体的分析体系，其化学转化路径如下：在酒石酸介质中，结合态氰化物经凯氏蒸馏转化为挥发性氢氰酸，通过2%氢氧化钠溶液吸收生成稳定氰化钠，中性缓冲条件下，氰离子与氯胺T发生亲核取代反应，生成活性中间体氯化氰，进而与异烟酸和吡唑啉酮缩合形成蓝色双偶氮化合物。此后，通过高效液相色谱法将其分离，并采用峰面积外标法计算含量。采用本法测定肉类中的氰化物，线性关系良好，方法灵敏度高，方法的准确度和精密度均符合检验要求。对肉类中氰化物的测定起到参考作用。
NOTES
*通讯作者。