摘要: 为研究蝙蝠蛾被毛孢–红景天–灵芝复方制剂的免疫调节作用，以SPF级昆明雄性小鼠为模型，灌胃给予225、450、900 mg/kg BW (相当于人体推荐用量的5、10、20倍)的样品，连续干预30天。采用噻唑蓝比色法、耳肿胀法、Jerne改良玻片法等检测脾淋巴细胞增殖、迟发型变态反应(DTH)、抗体生成细胞数等免疫指标。结果表明，该制剂可显著促进小鼠脾淋巴细胞转化、增强DTH反应、提高抗体生成细胞数及血清溶血素水平，并增强单核–巨噬细胞碳廓清能力，对小鼠体重及免疫器官发育无显著影响。本研究为该复方作为免疫调节类健康食品的开发提供实验依据。
Abstract: To investigate the immunomodulatory effects of a compound preparation containing Hirsutella sinensis, Rhodiola, and Ganoderma lucidum, SPF-grade male Kunming mice were used as the model. The mice were administered the sample via oral gavage at doses of 225, 450, and 900 mg/kg body weight (equivalent to 5, 10, and 20 times the recommended human dosage, respectively) for 30 consecutive days. Immune parameters, including splenic lymphocyte proliferation, delayed-type hypersensitivity (DTH) response, and antibody-producing cell count, were assessed using MTT colorimetric assay, ear swelling method, and Jerne’s modified slide method, respectively. The results demonstrated that the compound preparation significantly promoted splenic lymphocyte transformation, enhanced the DTH response, increased the number of antibody-producing cells and serum hemolysin levels, and improved the carbon clearance capacity of mononuclear-macrophages. No significant effects on body weight or immune organ development were observed in the mice. This study provides experimental evidence supporting the development of this compound preparation as a health food with immunomodulatory functions.
1. 引言
免疫稳态是机体健康的重要保障。免疫系统功能失衡不仅与感染性疾病频发相关，也是自身免疫性疾病及肿瘤等重大健康问题的重要诱因[1]-[3]。伴随现代生活节奏加快、环境压力增大以及人口老龄化趋势，亚健康状态下的免疫功能普遍低下已成为影响公众生活质量的显著问题。这一背景推动了药食同源类免疫调节食品的开发需求。
中药复方因其多成分、多靶点、多途径的特性，在免疫调节方面显示出独特优势。诸多药食同源类中药因其良好的安全性和确切的免疫调节活性，成为此类制剂开发的重要来源。其中，红景天作为抗应激、调节免疫的经典药材，其活性成分红景天苷可通过调节免疫细胞活性增强防御功能[4]。灵芝多糖是灵芝发挥免疫调节作用的主要成分之一。研究表明，灵芝多糖能通过激活巨噬细胞增强非特异性免疫[5] [6]。蝙蝠蛾被毛孢，又名冬虫夏草，其菌丝体提取物也具有免疫调节的潜力。腺苷是蝙蝠蛾被毛孢中的一种重要成分，可能在调节B细胞分化和维持免疫平衡方面发挥作用。将蝙蝠蛾被毛孢、红景天及灵芝等具有明确食药同源属性的原料进行科学配伍，有望通过其中多种活性成分的协同互作，实现对免疫系统更全面、更系统的调控。基于此，本文聚焦基于蝙蝠蛾被毛孢、红景天及灵芝等的复方制剂，通过建立小鼠免疫调节模型，从细胞免疫、体液免疫、单核–巨噬细胞功能和NK细胞活性四个维度综合判定，评估该复方对免疫应答各环节的影响，旨在为药食同源复方在食品工业的应用提供理论支撑和实践参考。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 样品制备
蝙蝠蛾被毛孢–红景天–灵芝复方制剂由江苏云德科技有限公司提供，为棕黄色粉末。其制备方法如下：称取红景天350 g、灵芝450 g、黄芪700 g、党参500 g，置于提取罐中，分别用10倍、8倍量的水煮提取两次，每次2小时，提取液经120目不锈钢筛过滤后合并，弃去药渣。将所得滤液减压浓缩，得稠浸膏。再将稠浸膏真空干燥、粉碎过80目筛，得干膏细粉。与35 g蝙蝠蛾被毛孢菌丝体细粉、3 g硬脂酸镁细粉均匀混合，即得制剂粉。
设复方制剂样品低、中、高剂量组分别为225、450、900 mg/kg BW，相当于人体推荐用量5、10和20倍。称取复方制剂，加纯水配制成11.25、22.50、45.00 mg/mL的混悬液，4℃保存备用。
2.1.2. 实验动物与饲养条件
SPF级健康昆明种雄性小鼠200只，体重18~22 g，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(粤)2008-0002，质量合格证号0081801。动物饲养于屏障系统实验室(使用许可证号SYXK(粤)2007-003)，温度22℃~25℃，相对湿度55%~70%，12 h光照/黑暗循环，自由摄食饮水。适应期7天后开始实验。
2.2. 试验方法
将200只小鼠按体重随机分为5组，每组40只，包括阴性对照组(纯水灌胃)和低、中、高3个剂量实验组。根据检测指标不同，将5组定义为不同免疫功能检测组：免疫I组：进行ConA诱导的脾淋巴细胞转化实验、NK细胞活性测定；免疫II组：进行迟发型变态反应实验；免疫III组：进行脏器/体重比值测定、血清溶血素测定和抗体生成细胞数测定；免疫IV组：进行碳廓清实验；免疫V组：进行腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验。采用灌胃方式给予样品，灌胃体积为0.2 mL/10 g BW，每日1次，连续30天。实验期间定期称量小鼠体重，观察饮食及活动状态。
根据2003年版的《保健食品检验与评价技术规范》[7]，免疫功能指标通过相应的检测方法进行评估。
2.3. 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，组间比较用Dunnett’s检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义。数据以“平均值 ± 标准差”表示。
3. 结果与分析
3.1. 复方制剂对小鼠体重及免疫器官的影响
如表1所示，各剂量组小鼠初始、中期、末期体重及增重与阴性对照组无显著差异(P > 0.05)。表明样品对各免疫组小鼠的体重增长均无明显影响，其安全性可能与成分的药食同源属性相关。
免疫器官脏器/体重比值检测结果显示(表2)，各剂量组小鼠的胸腺/体重、脾脏/体重比值与阴性对照组相比均无显著差异(P > 0.05)。其中，高剂量组胸腺/体重比值为0.194%，脾脏/体重比值为0.379%；对照组胸腺/体重比值为0.207%，脾脏/体重比值为0.393%。结果提示，样品未对免疫器官发育产生毒性作用，其免疫调节效应并非通过促进器官增生实现。
Table 1. Effect of the compound preparation on body weight of experimental mice
表1. 复方制剂对试验小鼠体重的影响
组别 |
剂量 (mg/kg BW) |
初始体重(g) |
中期体重(g) |
末期体重(g) |
增重(g) |
免疫I组 |
高剂量组 |
900 |
20.4 ± 1.3 |
32.1 ± 1.8 |
39.7 ± 2.1 |
19.3 ± 1.4 |
中剂量组 |
450 |
20.0 ± 1.1 |
30.9 ± 1.9 |
38.4 ± 2.3 |
18.4 ± 1.8 |
低剂量组 |
225 |
20.6 ± 1.1 |
32.0 ± 2.3 |
39.9 ± 2.9 |
19.3 ± 2.9 |
阴性对照组 |
0 |
19.9 ± 1.1 |
30.8 ± 1.8 |
38.5 ± 2.0 |
18.7 ± 1.7 |
免疫II组 |
高剂量组 |
900 |
20.6 ± 1.3 |
32.5 ± 2.2 |
40.4 ± 2.1 |
19.8 ± 1.7 |
中剂量组 |
450 |
20.2 ± 0.9 |
31.2 ± 2.5 |
39.2 ± 3.3 |
19.0 ± 2.5 |
低剂量组 |
225 |
20.0 ± 1.0 |
31.9 ± 2.5 |
39.6 ± 2.5 |
19.7 ± 1.9 |
阴性对照组 |
0 |
20.5 ± 0.8 |
32.3 ± 1.7 |
40.4 ± 1.9 |
20.0 ± 1.8 |
免疫III组 |
高剂量组 |
900 |
20.7 ± 1.1 |
33.0 ± 0.9 |
40.7 ± 1.9 |
20.1 ± 1.6 |
中剂量组 |
450 |
20.3 ± 1.1 |
31.6 ± 1.7 |
39.6 ± 2.3 |
19.2 ± 2.2 |
低剂量组 |
225 |
20.1 ± 1.0 |
31.9 ± 1.7 |
40.0 ± 1.9 |
20.0 ± 1.3 |
阴性对照组 |
0 |
20.1 ± 1.0 |
32.0 ± 1.8 |
39.7 ± 1.7 |
19.6 ± 1.2 |
免疫IV组 |
高剂量组 |
900 |
20.0 ± 1.0 |
31.6 ± 1.6 |
39.6 ± 1.9 |
19.6 ± 1.9 |
中剂量组 |
450 |
20.3 ± 0.7 |
32.2 ± 1.2 |
40.2 ± 1.0 |
19.9 ± 1.0 |
低剂量组 |
225 |
20.6 ± 1.1 |
32.3 ± 2.3 |
40.5 ± 2.4 |
19.9 ± 1.7 |
阴性对照组 |
0 |
20.5 ± 1.0 |
31.9 ± 1.6 |
40.0 ± 1.8 |
19.5 ± 1.1 |
免疫V组 |
高剂量组 |
900 |
19.5 ± 1.0 |
31.0 ± 1.6 |
38.6 ± 2.1 |
19.1 ± 1.6 |
中剂量组 |
450 |
20.4 ± 1.2 |
32.1 ± 1.6 |
40.4 ± 1.9 |
20.0 ± 1.6 |
低剂量组 |
225 |
20.4 ± 0.6 |
31.7 ± 1.2 |
39.4 ± 1.6 |
19.0 ± 1.2 |
阴性对照组 |
0 |
20.1 ± 0.8 |
31.8 ± 1.2 |
39.7 ± 1.0 |
19.6 ± 1.0 |
Table 2. Effect of the compound preparation on immune organ-to-body weight ratios of experimental mice
表2. 复方制剂对试验小鼠的免疫器官脏器/体重比值的影响
组别 |
剂量 (mg/kg BW) |
胸腺/体重(%) |
P值 |
脾脏/体重(%) |
P值 |
高剂量组 |
900 |
0.194 ± 0.023 |
0.403 |
0.379 ± 0.037 |
0.780 |
中剂量组 |
450 |
0.206 ± 0.024 |
0.996 |
0.399 ± 0.054 |
0.981 |
低剂量组 |
225 |
0.194 ± 0.021 |
0.433 |
0.387 ± 0.024 |
0.977 |
阴性对照组 |
0 |
0.207 ± 0.021 |
- |
0.393 ± 0.048 |
- |
3.2. 复方制剂对小鼠细胞免疫功能的影响
由表3可知，高、中、低剂量组淋巴细胞增殖OD值分别为0.325、0.288、0.250，较对照组分别提高83.6%、62.7%、41.2%。这一剂量依赖性增强效应提示，样品可有效激活T淋巴细胞介导的免疫应答，其机制可能与复方中多糖激活NF-κB信号通路，促进IL-2分泌有关[8]。
Table 3. Results of lymphocyte transformation and delayed-type hypersensitivity (DTH) in mice treated with the compound preparation
表3. 复方制剂的小鼠淋巴细胞转化及迟发型变态反应(DTH)实验结果
组别 |
剂量 (mg/kg BW) |
淋巴细胞增殖能力(OD值) |
P值 |
左右耳片重量差值(mg) |
P值 |
高剂量组 |
900 |
0.325 ± 0.077 |
0.000 |
20.50 ± 6.51 |
0.025 |
中剂量组 |
450 |
0.288 ± 0.051 |
0.001 |
19.17 ± 4.80 |
0.086 |
低剂量组 |
225 |
0.250 ± 0.066 |
0.033 |
17.75 ± 3.97 |
0.261 |
阴性对照组 |
0 |
0.177 ± 0.047 |
- |
13.80 ± 6.10 |
- |
高剂量组(900 mg/kg)耳片重量差值为20.50 mg，较对照组增加48.6%，差异具有显著性(P < 0.05)；中、低剂量组虽有升高趋势，但未达显著水平(P > 0.05)，这表明高剂量样品可增强Th1细胞介导的炎症反应，可能与红景天苷调节T细胞亚群分化，提升IFN-γ分泌有关[9]。
3.3. 复方制剂对小鼠体液免疫功能的影响
如表4，高、中剂量组溶血空斑数分别为226.9 × 103/106脾细胞、205.1 × 103/106脾细胞，较对照组增加37.9%和24.6%，差异均具有显著性，低剂量组虽有升高，但未达显著水平(P > 0.05)。高、中剂量组抗体积数分别为189.0、179.9，较对照组提高19.9%和14.2%；低剂量组与对照组无显著差异(P > 0.05)。研究结果表明样品可促进B淋巴细胞增殖分化及抗体分泌，其作用可能与蝙蝠蛾被毛孢菌丝体中的腺苷成分调节B细胞受体信号通路相关[10]。
Table 4. Results of antibody-producing cell count and serum hemolysin level in mice treated with the compound preparation
表4. 复方制剂的抗体生成细胞及小鼠溶血素检测实验结果
组别 |
剂量 (mg/kg BW) |
溶血空斑数
(1 × 10/106脾细胞) |
P值 |
抗体积数 |
P值 |
高剂量组 |
900 |
226.9 ± 40.8 |
0.000 |
189.0 ± 21.6 |
0.000 |
中剂量组 |
450 |
205.1 ± 23.6 |
0.011 |
179.9 ± 12.2 |
0.013 |
低剂量组 |
225 |
195.6 ± 27.8 |
0.062 |
168.7 ± 12.3 |
0.324 |
阴性对照组 |
0 |
164.6 ± 21.8 |
- |
157.6 ± 18.5 |
- |
3.4. 复方制剂对小鼠单核–巨噬细胞功能的影响
如表5，高剂量组吞噬指数为9.05，较对照组提高18.3%，差异显著(P < 0.05)；中、低剂量组虽有升高趋势，但未达显著水平(P > 0.05)，表明样品可增强单核–巨噬细胞系统对异物的清除能力[11]，这可能与灵芝多糖等活性成分激活巨噬细胞吞噬功能相关[5] [6]。
Table 5. Effect of the compound preparation on carbon clearance capacity in mice
表5. 复方制剂对小鼠碳廓清功能的影响
组别 |
剂量(mg/kg BW) |
吞噬指数 |
P值 |
高剂量组 |
900 |
9.05 ± 0.99 |
0.036 |
中剂量组 |
450 |
8.71 ± 1.00 |
0.137 |
低剂量组 |
225 |
8.60 ± 1.42 |
0.199 |
阴性对照组 |
0 |
7.65 ± 1.33 |
- |
由表6可知，各剂量组吞噬率及吞噬指数与对照组相比均无显著差异(P > 0.05)，提示样品对局部巨噬细胞的吞噬活性无明显影响。总体而言，样品对巨噬细胞的调节具有组织选择性，可能与复方中多糖在肝脏中的分布浓度较高有关[12]。
Table 6. Effect of the compound preparation on phagocytic capacity of peritoneal macrophages against chicken red blood cells in mice
表6. 复方制剂对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
组别 |
剂量 (mg/kg BW) |
吞噬率(%) |
P值 |
吞噬指数 |
P值 |
高剂量组 |
900 |
28.8 ± 4.8 |
0.515 |
0.61 ± 0.10 |
0.686 |
中剂量组 |
450 |
27.8 ± 4.2 |
0.797 |
0.60 ± 0.12 |
0.731 |
低剂量组 |
225 |
26.6 ± 2.8 |
0.990 |
0.55 ± 0.11 |
1.000 |
阴性对照组 |
0 |
26.3 ± 7.4 |
- |
0.55 ± 0.19 |
- |
3.5. 复方制剂对小鼠NK细胞活性的影响
表7显示，各剂量组小鼠NK细胞活性与阴性对照组均无显著差异(P > 0.05)，表明样品对固有免疫中NK细胞的杀伤功能未产生明显影响。其中，高剂量组NK细胞活性为24.84%，较对照组降低4.86%，这可能与红景天苷抑制NK细胞过度活化的免疫平衡作用相关，也可能与蝙蝠蛾被毛孢菌丝体的腺苷剂量未达有效阈值有关[13]。中剂量组与对照组基本持平，低剂量组为28.15%，较对照组升高7.81%。
Table 7. Effect of the compound preparation on NK cell activity in mice
表7. 复方制剂对小鼠NK细胞活性的影响
组别 |
剂量(mg/kg BW) |
NK细胞活性(%) |
P值 |
高剂量组 |
900 |
24.84 ± 3.29 |
0.806 |
中剂量组 |
450 |
26.20 ± 3.24 |
1.000 |
低剂量组 |
225 |
28.15 ± 5.65 |
0.576 |
阴性对照组 |
0 |
26.11 ± 3.27 |
- |
4. 讨论
本研究表明，蝙蝠蛾被毛孢–红景天–灵芝复方制剂可通过促进T淋巴细胞增殖、增强DTH反应，提升抗体生成细胞数及血清溶血素水平，并增强单核–巨噬细胞碳廓清能力等多途径调节免疫功能(图1)，这种多靶点效应与其复方成分的协同作用密切相关。红景天苷可通过调节T细胞亚群分化，促进IL-2、IFN-γ等细胞因子分泌，增强细胞免疫[14]；黄芪多糖可通过激活NF-κB信号通路促进T细胞分泌IL-2 [15]，党参皂苷能调节Th1/Th2细胞平衡[16]，二者协同增强细胞免疫。灵芝多糖通过与巨噬细胞表面CR3受体结合，促进吞噬体成熟[17]，而红景天苷可通过抑制MAPK通路降低炎症因子过度表达[18]，共同改善非特异性免疫。蝙蝠蛾被毛孢菌丝体中的腺苷成分可能通过A2A受体调节B细胞分化，促进抗体生成[19]。这些成分的相互作用，不仅增强了机体的免疫防御能力，还可能在免疫调节中发挥平衡作用，避免了免疫过度激活导致的炎症反应，从而维持了免疫系统的稳态。
Figure 1. Analysis of the mechanism underlying the effect of the compound preparation on immune function in mice
图1. 复方制剂对小鼠免疫功能的影响机制分析
样品中红景天苷、腺苷、粗多糖的含量与其免疫调节效果呈现剂量依赖性。高剂量组(900 mg/kg)在淋巴细胞转化、DTH、碳廓清等指标上显著优于中、低剂量组，这可能与活性成分的生物利用度相关。研究表明，红景天苷在50~200 mg/kg时可显著提升巨噬细胞吞噬率[20]，灵芝多糖的免疫激活效应具有剂量依赖性，黄芪多糖的免疫激活阈值为200~1000 mg/kg [21]，与本研究结果一致。值得注意的是，低剂量组(225 mg/kg)仅在淋巴细胞转化实验中表现出显著效应，而对体液免疫和碳廓清的影响不显著，提示其作用可能存在“剂量窗”。这可能与复方中多种成分的协同阈值有关，如当粗多糖浓度低于某一水平时，其免疫刺激作用不足以激活下游信号通路。进一步研究需明确各成分的最佳配比及协同机制，以优化本复方制剂的免疫调节效果。同时，探讨其在不同免疫状态下的适用性，为临床应用提供更全面的依据。
与单味中药制剂相比，蝙蝠蛾被毛孢–红景天–灵芝复方制剂的复方配伍展现出优势。例如，单一灵芝多糖主要增强巨噬细胞功能，单一黄芪多糖在200mg/kg时选择性增强NK细胞活性[22] [23]，而本复方在900 mg/kg时可同时调节细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞功能。此外，该复方因同时含有红景天和蝙蝠蛾被毛孢菌丝体，在抗应激和提升抗体生成方面更具特色。然而，本研究中NK细胞活性未受显著调节，可能与蝙蝠蛾被毛孢菌丝体剂量不足、复方中其他成分的拮抗效应，或成分间相互作用有关。有研究显示，蝙蝠蛾被毛孢提取物在500~3000 mg/kg剂量范围内，可通过腺苷依赖途径显著激活NK细胞[13] [24]，而本研究的最高剂量组中蝙蝠蛾被毛孢实际剂量低于270 mg/kg，远低于单用有效阈值，这也是后续研究需优化的方向。
5. 结论
蝙蝠蛾被毛孢–红景天–灵芝复方制剂可通过促进脾淋巴细胞增殖、增强迟发型变态反应、提升抗体生成能力及单核–巨噬细胞碳廓清功能，发挥多维度免疫调节作用，且对小鼠体重、免疫器官发育无明显影响。其作用机制可能与红景天苷、腺苷、多糖等活性成分激活NF-κB信号、调节免疫细胞功能相关。本研究为该复方作为免疫调节类健康食品的开发提供了实验依据，其具体成分的协同机制及临床应用价值需进一步研究。
基金项目
江苏省重点研发计划项目(BE2017364)。
NOTES
*通讯作者。