蝉花虫草酒免疫功能研究

Study on the Immune Activity of Cordyceps cicadae Wine

摘要: 本研究通过ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验和二硝基氟苯诱导小鼠DTH实验、抗体生成细胞实验和血清溶血素实验、小鼠碳廓清实验和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验及NK细胞活性测定实验分别研究了蝉花虫草酒对小鼠细胞免疫、体液免疫、单核巨噬细胞功能和NK细胞活性的影响作用。结果表明，蝉花虫草酒低、高剂量组均无明显细胞免疫增强功能；高剂量组能提高小鼠的溶血空斑数和小鼠抗体积数，具有增强体液免疫功能；与阴性对照组比较，高剂量组能够明显提高小鼠的碳廓清吞噬指数和巨噬细胞吞噬鸡红细胞指数，具有增强单核巨噬细胞的功能；高、低剂量组无明显提高小鼠NK细胞活性的作用。根据上述实验结果和2003版《保健食品检验与评价技术规范》的规定判定蝉花虫草酒有增强机体免疫力的作用。

Abstract: In the present work, the immunoregulatory function of Cordyceps cicadae wine on mouse cellular immunity, humoral immunity, mononuclear macrophage and NK cell activity was evaluated by ConA-induced mouse spleen lymphocyte transformation, dinitrofluorobenzene-induced mouse DTH, antibody-producing cell and serum hemolysin experiments, mouse carbon clearance experiments, and peritoneal macrophage phagocytosis of chicken red blood cells, and the NK cell activity assay, respectively. The results indicated that the low and high dose groups of Cordyceps cicadae wine had no cellular immune function; the high dose group could increase the numbers of hemolytic plaques and antibodies in mice with humoral immune function. Compared with the negative control group, high dose group significantly enhanced the clearance indexes of charcoal particles and the phagocytic, showing the function of mononuclear macrophage. However, the high and low dose groups had no significant effect on increasing mouse NK cell activity. According to the above experimental results and the provisions of the 2003 edition of “Technical Specifications for the Inspection and Evaluation of Health Foods”, it was confirmed that Cordyceps cicadae wine has the enhancing effect of immunity.

1. 引言

蝉花是我国传统名贵的中药材之一，是蝉棒束孢寄生在蝉幼虫上形成的虫菌复合体。其寒性、味道甘甜、无毒，具有散风热、定惊镇痉明目透疹等功效。最早的相关记载在公元五世纪的南北朝时期就出现了。后来，隋唐时期甄权、宋代苏颂、明李时珍均对其有所研究 [1]。我国云南、广东、四川、福建和浙江等多个省份有长期食用蝉花虫草的习惯。

现代药理学研究表明蝉花具有免疫调节 [2] [3] [4] [5] [6]、抗应激 [7]、抗肿瘤 [8] [9] [10]、镇静催眠 [4] [11] 和调节脂类代谢 [2] [12] 等作用。蝉花虫草的上述功能主要是野生或人工培育蝉花产品，而关于蝉花虫草酒功能的研究却鲜见报道。蝉花虫草酒是蝉花孢梗束和酒炙黄精经基酒浸泡60天制成。本研究根据国家保健食品相关法规要求在指定单位对蝉花虫草酒的免疫功能进行了评价研究 [13]。

2. 材料和方法

2.1. 样品

浙江泛亚保健食品有限公司提供。按照每升添加13.3 g蝉花子实体干品和1.4 g酒炙黄精，用42˚基酒浸泡60天，用纯水调配至38˚；同样用26.5 g蝉花子实体干品和2.9 g酒炙黄精，用42˚基酒浸泡60天，用纯水调配至38˚；分别得到低剂量和高剂量成品酒。然后通过蒸馏浓缩和调配使低剂量和高剂量含药量分别为18.18 g/L和36.36 g/mL，酒精度为15%。4℃冷藏。按照人体推荐量为2.66 g/日·60 kg BW进行免疫学试验研究 [14]。

2.2. 实验动物

ICR小鼠180只，清洁级，初始体重18~22 g，雄性，合格证号：201804353，由扬州大学比较医学中心提供。ICR小鼠60只，SPF级，初始体重18~22 g，雄性，合格证号：201808403，由南京医科大学提供。实验鼠粮，规格：20 kg/袋，江苏省协同医药生物工程有限公司提供。饲养环境：屏障实验室，温度18℃~24℃，相对湿度40%~70%。

2.3. 试剂与仪器

2.3.1. 主要试剂

小牛血清，Gibco，批号：1517927；谷氨酰胺，上海源叶生物科技有限公司，批号：L17J7G16278；刀豆蛋白，aladdin，批号：D1628065；MTT，Amresco提供；2,4二硝基氟苯(DNFB)，MACKLIN公司，批号：L10061077；绵羊红细胞(SRBC)，南京茂捷微生物科技有限公司，批号：20170904001；2%绵羊红细胞(SRBC)，平睿生物科技(北京)有限公司，批号：170911；1%鸡红细胞悬液，平睿生物科技(北京)有限公司，批号：170918；氧化性辅酶I，Amresco提供；Triton，天津市光复精细化工研究所等。

2.3.2. 主要仪器

XDS-1B显微镜，重庆光电仪器有限公司；UV1750分光光度计，日本岛津；HERA cell 150i CO₂培养箱，美国Thermo Electron公司；NU-430-400E超净工作台，美国NUAIRE；DS-671电子秤，上海寺冈电子有限公司；AL104电子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司；鼠静脉注射固定架；JS-306电子秒表，深圳市君斯达实业有限公司；550型酶标仪，Biorad公司等。

2.4. 剂量选择、受试样品给药方式和时间

人用剂量为2.66g/日，以人体60 kg计，即为0.045g/kg。以人体推荐量的20倍设为高剂量组(0.9 g/kg)，以10倍设为低剂量组(0.45 g/kg)。因样品本身分为两个浓度：16号，15 g/825mL (0.018 g/mL)，17号，30 g/825mL (0.036 g/mL)，故直接取原液进行实验。16号作为低剂量，17号作为高剂量。灌胃容积为均为0.25 mL/10g。蒸馏水作为阴性对照组，灌胃给药，每组10只。各组给相应的受试样品，每天1次，连续30天。

2.5. 实验方法

按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)的规定检测指标，参照白巍、吴小丽等人的方法进行 [15] [16]。

2.5.1. ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)

无菌取脾，置于适量无菌Hank’s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液；将细胞悬液用200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次1000 rpm离心10 min；将细胞悬浮于1 mL完全培养液中；台酚蓝染色计数活细胞数，并调整细胞浓度至3 × 10⁶个/mL。将每份脾细胞分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，其中一孔加75 μL ConA液，另一孔作为对照，将培养板置于5%CO₂、37℃培养箱中培养72h。培养结束前4 h，每孔吸去上清0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT (5 mg/ mL) 50 μL/孔，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。将溶液直接移入2 mL比色杯中，紫外分光光度计570 nm测定OD值。

2.5.2. 二硝基氟苯诱导小鼠DTH(耳肿胀法)实验

每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3 cm × 3 cm，用DNFB溶液50 μL均匀涂抹致敏。5天后，用DNFB溶液10 μL均匀涂抹于小鼠右耳(两面)进行攻击。攻击后24 h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8 mm的耳片，称重。

2.5.3. 抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)

在清洁玻片上刷一薄层琼脂糖，干后保存备用。将压积SRBC用生理盐水配成2% (v/v)的细胞悬液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL。将SRBC免疫4~5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000 r/min) 10 min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬液在5 mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×10⁶个/mL。将表层培养基加热溶解后，放45℃~50℃水浴保温，与等量pH7.2~7.4的2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5 mL，再向管内加50 μL 10% SRBC，20 μL脾细胞悬液(5 × 10⁶个/mL)，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入CO₂培养箱中孵育1~1.5 h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1:8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1~1.5 h后，计数溶血空斑数。

$抗体水平=\left(S_1+2S_2+3S_3\cdots n{S}_n\right)$

式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

0级 红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清皙。

I级 红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。

II级 凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。

III级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。

IV级 凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。

2.5.4. 血清溶血素的测定实验(血凝法)

将2% (v/v)压积SRBC的细胞悬液，每只小鼠腹腔注射0.2 mL进行免疫。4天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1 h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出。2000 r/min离心10 min，收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于96孔微量血凝实验板内，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5% (v/v)的SRBC的悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度。

2.5.5. 小鼠碳廓清实验

按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨水(0.1 mL/10g)，待墨汁注入，立即计时。注入墨水后2、10 min，分别从内眦静脉丛取血20 μL，并立即将其加到2 mL 0.1% Na₂CO₃溶液中。用紫外分光光度计在600 nm波长处测光密度值(OD)，以Na₂CO₃溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力，按下式计算吞噬指数a。

$K=\frac{\lg O{D}_1-\lg O{D}_2}{t_2-t_1}$

$吞噬指数a=\frac{体重}{肝重+脾重}\times \sqrt[3]{K}$

2.5.6. 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)

每只小鼠腹腔注射1%的鸡红细胞悬液1 mL。间隔30 min，脱臼处死。将其腹部朝上固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min。之后打开腹腔吸出腹腔液1 mL，平均分滴于2片载玻片上。在湿片盒内垫半湿的纱布(用温水湿透，置于培养箱内备用)。将加入腹腔液的载玻片小心放入垫有湿纱布的盒内，放置在37℃培养箱内孵育30 min。孵育结束后于生理盐水中漂洗，以除去未贴片的细胞，晾干。以丙酮甲醇固定液固定5 min，Giemsa应用液染色3 min。用蒸馏水冲洗干净，晾干。玻片于40×显微镜下计数吞噬率和吞噬指数。每张片计数100个巨噬细胞，吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数。

$吞噬百分率\left(\%\right)=\times 100$

$吞噬指数=\frac{被吞噬的鸡红细胞总数}{计数的巨噬细胞数}$

2.5.7. NK细胞活性测定

实验前24 h将靶细胞进行传代培养。用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞密度为4 × 105个/mL。无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，收集滤液；用Hank’s液洗2次，每次1000 r/min离心10 min；弃上清并将细胞浆弹起，加入0.5 mL灭菌水20 s (裂解红细胞)；再加入0.5 mL 2倍Hank’s液及8 mL Hank’s液，1000 r/min离心10 min；用1 mL含有10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬；用1%冰醋酸稀释后计数，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上)；用RPMI1640完全培养液调整细胞密度为2 × 107个/mL。取靶细胞和效应细胞各100 μL (靶效比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μL；靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5% Triton各100 μL；上述各项均设三个平行孔，于37℃、5% CO₂培养箱中培养4 h；然后将96孔培养板以1500 r/min，离心5 min；每孔吸取上清100 μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL；37℃，反应3 min，每孔加入1 M HCl 30 μL，在

酶标仪490 nm处测定光密度值(OD)。按下式计算NK细胞活性： $\frac{吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数}{计数的巨噬细胞数}$

$NK细胞活性\left(\%\right)=\frac{反应孔OD-自然释放孔OD}{最大释放孔OD-自然释放孔OD}\times 100\%$

2.6. 数据统计处理

实验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件进行方差齐性检验和单因素方差分析，使用Duncan新复极差法对不同实验组间数据进行差异显著性比较分析，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。

3. 结果与分析

3.1. 蝉花虫草酒的细胞免疫功能研究

通过小鼠胸腺系数、脾脏系数、ConA诱导的脾淋巴细胞转化、迟发性变态反应(耳肿胀度)实验研究了蝉花虫草酒的细胞免疫功能，结果如表1所示。经口给予小鼠不同剂量的蝉花虫草酒30天，小鼠的胸腺系数和脾脏系数与对照组相比均无显著性差异(P > 0.05)。不同剂量组蝉花虫草酒对小鼠脾淋巴细胞增殖能力和耳肿胀度也均无明显促进作用(P > 0.05)。

Table 1. Effects on organ/body weight ratio, splenic lymphocyte proliferation and delayed allergy in mice ( X ¯ ± S , n = 10)

表1. 对小鼠脏器/体重比值、脾淋巴细胞增殖能力和迟发性变态反应的影响( $\bar{X}\pm S$, n = 10)

3.2. 蝉花虫草酒的体液免疫功能研究

通过小鼠抗体生成细胞实验和血清溶血素实验，研究了蝉花虫草酒的体液免疫功能研究，结果见表2。蝉花虫草酒高剂量组溶血空斑数和抗体积数均显著高于对照组和低剂量组(P < 0.05)，表明高剂量蝉花虫草酒具有促进小鼠的抗体生成细胞增殖和提高小鼠的血清溶血素水平的作用。与宋捷民等人对蝉花免疫功能的研究结果一致 [4]。

Table 2. Effect on the number of hemolytic plaque and serum hemolysin in mice ( X ¯ ± S , n = 10)

表2. 对小鼠溶血空斑数和血清溶血素的影响( $\bar{X}\pm S$, n = 10)

注：与阴性对照组比较，^*P < 0.05。

3.3. 蝉花虫草酒的单核巨噬细胞功能研究

通过小鼠碳廓清实验和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验研究了蝉花虫草酒对小鼠单核巨噬细胞功能的影响，结果见表3。与对照组比较，蝉花虫草酒低剂量组和高剂量组均能明显提高小鼠的碳廓清吞噬指数(P < 0.05)，表明蝉花虫草酒能明显促进小鼠单核巨噬细胞的碳廓清功能。

与对照组相比，蝉花虫草酒高剂量组小鼠单核巨噬细胞鸡红细胞吞噬指数显著高于对照组(P < 0.05)，表明高剂量蝉花虫草酒可以提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力。根据单核巨噬细胞功能测定结果中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定蝉花虫草酒的单核巨噬细胞功能测定结果阳性。表明蝉花虫草酒能提高小鼠单核巨噬细胞吞噬活性，具有促进免疫功能的作用。与李成、宋捷民等人的研究结果一致 [3] [4]。

Table 3. Effects on carbon clearance and phagocytosis of chicken erythrocytes by peritoneal macrophages in mice ( X ¯ ± S , n = 10)

表3. 对小鼠碳廓清和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响( $\bar{X}\pm S$, n = 10)

注：与阴性对照组比较，^*P < 0.05，^**P < 0.01。

3.4. 蝉花虫草酒对小鼠NK细胞活性的影响

通过小鼠NK细胞活性测定实验研究了蝉花虫草酒对小鼠NK细胞活性的影响，结果如表4所示。蝉花虫草酒的低剂量组和高剂量组与对照组比较均无显著性差异(P > 0.05)，表明蝉花虫草酒对小鼠NK细胞活性无显著影响(P > 0.05)。

Table 4. Effect on NK cell activity of mice ( X ¯ ± S , n = 10)

表4. 对小鼠NK细胞活性的影响(, n = 10)

4. 讨论

现代免疫学认为，免疫力是机体自身的一种防御机制，是机体识别和消灭外来异物，识别和处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞和病毒感染细胞的能力。人体的免疫力受遗传基因和环境因素的影响，如饮食、睡眠、运动、压力等。其中，饮食对免疫力具有决定性的影响，有些食物或药物的成分能刺激免疫系统，增强机体免疫能力。

本实验以蝉花虫草酒0.45 g/kg.BW/d (低剂量)和0.9 g/kg.BW/d (高剂量)两个剂量经口给予小鼠一个月，进行小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能及NK细胞活性测定。结果表明，蝉花虫草酒高剂量组能够显著提高小鼠的溶血空斑数和小鼠抗体积数，具有增强体液免疫功能的作用；蝉花虫草酒高、低剂量组能明显提高小鼠的吞噬指数，高剂量组还可显著提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，可判定蝉花虫草酒具有增强单核巨噬细胞吞噬活性的作用。

按照中华人民共和国原卫生部颁布的《保健食品检验与评价技术规范(2003年版)》对免疫功能的结果判定规则：“在细胞免疫、体液免疫、单核巨噬细胞及NK细胞活性4个方面任2个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用” [13] [17]。本实验结果证实蝉花虫草酒能够增强小鼠体液免疫功能和单核巨噬细胞吞噬功能，故此可以判定蝉花虫草酒具有免疫增强功能，有增强机体免疫力的作用。

基金项目

科技部星火计划项目(2015GA710033)；滁州学学院科研项目(2017PY04)；滁州学院大学生创新训练项目(2019CXXL114)。

NOTES

^*通讯作者。