1. 引言
据统计，我国果酒的年消费量目前正在以15%的速度增长，消费者健康意识的提高使得果酒发展前景十分广阔 [1]。果酒市场的主流是葡萄酒，产量最大，但果酒在我国酒类中属于一个小品种，因此亟需对葡萄酒以外的其他种类的果酒进行开发，加快开发水果酿造的果酒，既能够解决粮食酒耗粮问题，还可以增加附加值，减少水果运输、贮藏中的损耗 [2]。
果酒具有免疫抑制、抗氧化、抗炎、镇痛、心脏保护、抗菌、胃保护和皮肤改善等作用 [3]。果酒的风味与消费者的偏好关系紧密。果酒风味的形成与其中的挥发性物质有关。果酒中的挥发性成分种类繁多，这些香气成分一部分来自水果本身具有的香气物质，另一部分来自于后期的发酵过程 [4]。果酒的香气成分由水果自身保留的香气成分和发酵过程产生的芳香物质组成，往往给果酒带来清新香甜的味道 [5]。因此香气成分对果酒至关重要，决定着果酒品质的好坏。
本研究以太行山区主产赤霞珠葡萄、阜平大枣、富士苹果和磨盘柿为原料，以常规果酒加工工艺发酵果酒，对几种果酒的香气成分和抗氧化性能力进行了检测分析，研究结果将促进当前果酒加工的多元化发展，符合目前果酒产业的发展需求。
2. 材料与方法
2.1. 主要材料与试剂
磨盘柿，购于保定满城柿子沟；阜平大枣，购于保定市阜平县；赤霞珠葡萄，购于张家口怀来县；红富士苹果，购于保定市曲阳县果园；无水乙醇(色谱纯)，天津市天力化学试剂有限公司；叔戊醇，乙酸正戊酯和2-乙基丁酸等均为分析纯。
2.2. 主要仪器与设备
Agilent 7890GC-5977 MS型气相色谱–质谱联用仪，美国Agilent公司；SPME (CAR/PDMS/DVB萃取头)，美国Supelco公司；TU-1810紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。
2.3. 试验条件
1、原料发酵制酒处理均采用液态果酒生产工艺，根据自身的特点不同就行微调，均选用安琪BV818果酒酵母 [6]，添加量为0.2~0.4 g/L，加入酵母之前要进行活化，将干酵母放入4%葡萄糖溶液中，溶液温度35℃~40℃，活化20 min，活化后应立即加入原料，糖度24%，发酵温度25℃，后发酵一个月 [7]。
2、基本理化指标的测定四种水果发酵酒的酒精度，总糖，总酸，游离二氧化硫，挥发酸的测定方法均参照GB/T15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法进行测定。水果发酵酒中菌落总数、大肠菌群、致病菌的微生物指标参照GB2758-2005发酵酒卫生标准进行检测。
3、香气成分测定量取8 mL的酒样于顶空瓶中，40℃水浴预热平衡10 min，然后将活化好的萃取头插入样品瓶中(活化条件按照萃取头所附带的指南操作) [8]，40℃水浴萃取40 min，然后取出。每个样品做三次平行处理 [9]。进样口温度为250℃，解析时间为8 min [10]。
GC条件色谱柱：HP-innowax毛细管色谱柱(60 m × 0.25 mm × 0.25 µm)；升温程序：50℃保持2 min，以7℃/min升温到250℃保持10 min；载气(He)流速1.0 mL/min；进样口温度250℃ [11]。
质谱条件离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子轰击(EI)离子源，电子能量70 eV，采集类型：全扫描，质量扫描范围m/z33~350，辅助加热器温度250℃ [12]。
4、抗氧化活性的测定以酿造的四种水果发酵酒作为原液，分别稀释成20%，40%，60%，80%，100%的待测液，以2 mg/mL的维生素C溶液作为对照，同样稀释成20%，40%，60%，80%，100%的浓度梯度，置于冰箱中备用。
DPPH自由基清除活性的测定参考W.M. Brand-Williams等 [13] 的方法，取样品待测液2.0 mL于10 mL玻璃试管中，加入2.0 mL的0.2 mmol/L新鲜制备的DPPH乙醇溶液，涡旋使其充分混匀。室温下避光反应30分钟，无水乙醇调零，在波长为517 nm下测定吸光度，测得结果为A1。取2.0 mL酒样，加入2.0 mL无水乙醇，充分混合，于同样条件下测定混合液的吸光度，测得结果为A2。再于同样条件下测定2.0 mL同浓度的DPPH溶液与2.0 mL无水乙醇混合液吸光度，测定结果为A3。
DPPH清除率计算公式如下：
羟基自由基清除能力的测定参考徐艳岩 [14] 对羟自由基清除能力的测定方法对四种水果发酵酒羟自由基清除能力进行测定。
5、功能性成分测定总酚含量的测定：参考Julkunen-Tiitto等 [15] 的测定方法，采用福林酚试剂法测定几种水果发酵酒中总酚含量。在765 nm波长条件下测定没食子酸系列浓度溶液的吸光度，绘制没食子酸标准曲线。以吸光度(A)对没食子酸浓度(c)进行线性回归。果酒中总酚含量以没食子酸的当量浓度表示，单位为GAE mg/L。
总黄酮含量的测定：采用硝酸铝显色法测定酒样中的总黄酮含量。参考邓长生等 [16] 的测定方法。
果酒中环磷酸腺苷(cAMP)含量测定：参考苏豫梅等 [17] 的测定方法测定四种水果发酵酒中cAMP的含量，以峰面积对标准品cAMP浓度(mg/mL)进行线性回归，绘制cAMP标准曲线。在同样条件下测定样品中cAMP的峰面积并计算其含量。
6、感官评定组织10名有相关经验的评酒员，从外观(满分10分)、香气(满分30分)、滋味(满分40分)、典型性(满分20分) 4个方面对四种成品果酒进行品尝鉴定，酒样总分为4项得分之和(表1)。
Table 1. Sensory evaluation of fruit fermented wine
表1. 水果发酵酒的感官评定表
注：完美，85~100；很好，80~85；好，70~80；一般，50~70；不好，<50。
7、试验结果统计分析方法采用Excel、Origin8.6和SPSS 17.0软件进行数据处理和统计分析。所有样品均平行测定3次，测定结果以平均值士标准偏差(mean ± SD)表示，显著性界值P = 0.05。
3. 结果与分析
3.1. 四种水果发酵酒基本理化指标
四种水果发酵酒的基本理化指标结果如表2示。从表2可知：在四种水果发酵酒中，发酵酒酒度均控制在13% vol左右，残糖量低于5 g/L。符合NY/T1508-2017绿色食品果酒标准，因此四种水果发酵酒属于干型果酒，总酸含量范围为3.75~6.81 g/L，总酸含量均小于9 g/L。由此可知四种果品原料采用国产安琪酵母均能正常发酵，能够达到国标中水果发酵酒的要求。
Table 2. Physical and chemical indexes of four fruit fermented wine
表2. 四种水果发酵酒的理化指标
注：同列中不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。
3.2. 四种水果发酵酒香气成分分析
1、相对含量分析固相微萃取(SPME)–气相色谱(GC)–质谱(MS)分析结果显示葡萄发酵酒、苹果发酵酒、枣发酵酒香气和柿子发酵酒总的香气成分相对含量分别为54.776%、56.473%、60.213%和62.33%，数据显示柿子发酵酒的总含量在这四种果酒中是最高的，枣发酵酒其次，葡萄和苹果发酵酒相对较低。
2、四种水果发酵酒香气成分。
Table 3. Detailed analysis of aroma components of four kinds of fruit fermented wine
表3. 四种水果发酵酒的香气成分详细分析
果酒的香气成分主要包含醇类、脂类、酸类、醛类等 [18]。在四种果酒中检测到大量的酯类，多达38种，而在这4种水果发酵酒中有八种共有成分，它们分别是乙酸乙酯、醋酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、十六酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯。酯类化合物是水果发酵酒中主要的风味物质，具有较高的相对质量分数。枣发酵酒和柿子发酵酒中高达50.859%和50.043%，苹果发酵酒和葡萄发酵酒也含有47.179%和32.876%。在酯类中如辛酸乙酯，癸酸乙酯等均具有浓郁的水果香气，酯类是果酒中一类重要的香气物质 [19]。在柿子发酵酒中，癸酸乙酯(13.185%、果香气味)，辛酸乙酯(9.244%、果香气味)、十二酸乙酯(12.191%、花香)、乙酸乙酯(7.58%、菠萝，甜果味)、十六酸乙酯(4.252%、花香)和醋酸异戊酯(3.918%、香蕉气味)质量分数较高，很好的形成了柿子酒的典型风味 [20]。
果酒中的酸类成分对果酒的风味起到至关重要的作用 [21]。酒体中酸含量对酒的后味影响较大，当酒体中酸含量较少时，酒味寡淡且余味短；酸含量大时，则酒味过烈且粗糙 [22]。因此分析香气成分物质时要考虑到各香气物质之间的拮抗和协同作用，只有适量酸含量才能使酒体中的各种香气物质趋于平衡、协调，烘托出酒的主体香 [22]。
在4种果酒中共检测出7种挥发性有机酸，其中乙酸、辛酸在这四种水果发酵酒中均存在，是所有果酒中共有的。柿子发酵酒中主要含有乙酸(2.873%)，辛酸(1.866%)和癸酸(1.864%)。另外甲酸(0.129%)和己酸(0.140%)只在柿子发酵酒中检测出来，在其他果酒中未发现。
醇类物质由糖代谢、氨基酸脱氢脱羧作用生成，是陈酿后酯类物质的前体物质。醇类组分也是果酒中重要的挥发性物质，主要来自果酒发酵过程，可赋予酒特殊的香气 [23]。由表3可知，在葡萄酒，苹果酒，枣酒和柿子酒中分别检测出6，7，4和4种醇类化合物。柿子发酵酒中质量分数较高的是异戊醇(2.517%)，苯基乙醇(0.739%)，2,3-丁二醇(0.358%)。苯乙醇、2-甲基-1-丙醇以及异戊醇在4种果酒中均存在，是4种果酒中共有的醇类物质。苯乙醇具有特殊的香气风味，如紫罗兰香、玫瑰香等花香味以及矿物味、香料辛辣味、果味等，是构成水果蒸馏酒主要特征组分 [24]。
在四种果酒中还检测出酮类、酚类和呋喃类三种组分。其中，酮类化合物中二羟基丙酮只在柿子发酵酒中检测出，可赋予柿子果酒甜味和特殊香气 [25]；另外还检测出一部分萜烯类和降类异戊二烯组分：苯乙烯，反式β-罗勒烯，香叶里拉醇等为柿子发酵酒中的特有成分，β-罗勒烯可赋予柿子酒温暖的草香气温 [26]，香叶里拉醇可赋予柿子酒木香味 [27]，虽然各类组分的化合物的种类比较少、相对质量分数也较低，但考虑到这些化合物的阈值，它们也可能是柿子果酒中重要的风味物质 [28]。
3.3. 抗氧化活性分析
1、DPPH自由基清除能力四种果酒对DPPH自由基清除能力如图1所示。从图1中可知，四种发酵酒的DPPH自由基清除率随着浓度的增加均呈上升趋势，参照100%原液的清除率测定结果，其中葡萄、枣、柿子发酵酒的清除率均比2 mg/mLVc的清除率效果要好，而苹果发酵酒的清除率低于Vc (69.73%)的清除能力。四种水果发酵酒的DPPH自由基清除率比较结果为：葡萄发酵酒(72.50%) > 枣发酵酒(71.70%) > 柿子发酵酒(70.98%) > 苹果发酵酒(68.72%)，这与随后的总酚和总黄酮含量测定结果相吻合。
Figure 1. DPPH clearance rate of four fruit fermented wines
图1. 四种水果发酵酒对DPPH的清除率
2、羟基自由基清除能力四种果酒对羟基自由基清除能力如图2所示。从图2中可知，各水果发酵酒的羟自由基清除率都是随着酒样浓度的增加而增大。四种品种的发酵果酒的羟自由基清除率大小为：葡萄酒(89.1%) > 枣酒(78.2%) > 苹果(57.81%) > 柿子酒(56.66%)，四种发酵酒原液对羟自由基的清除能力均高于2 mg/mLVc的清除能力。总体说来，在四种果酒中，葡萄酒和枣酒的抗氧化能力较强。
Figure 2. Comparison of hydroxyl radical scavenging ability of four fruit fermented wines
图2. 四种水果发酵酒羟自由基清除能力对比
3.4. 功能性成分分析
1、水果发酵酒中总酚含量分析酚类化合物被看做是一类非常重要的生物活性成分，酚类化合物一般体现较强的抗氧化性能。本次试验对四种水果发酵酒总酚的含量进行了测定。利用福林酚法测定四种水果发酵酒中的总酚含量，以酒样单位体积内没食子酸标准品的当量来表示酒样的总酚含量。
没食子酸溶液浓度X与吸光度Y呈现良好的线性关系，其标准曲线方程为
，R2 = 0.9990，绘制标准曲线如图3所示。
从图4可知，四种发酵酒的总酚含量的比较结果为：葡萄酒 > 枣酒 > 苹果酒 > 柿子酒。四种水果发酵酒中总酚含量最高的是葡萄发酵酒(1155.03 GAE mg/L)，应该是葡萄酒中含有更多的原花青素和单宁等物质，因为葡萄酒是带皮渣发酵，酒中保留了更多原花青素和植物单宁。其次是枣发酵酒(983.67 GAE mg/L)，根据郝会芳 [29] 对枣果中多酚物质的测定得出赞皇大枣各组织中多酚含量大小比较为：枣核 > 枣皮 > 枣肉，枣皮中的多酚含量要比果肉中含量高，因此可能是由于枣酒在制备过程中带核带皮一起预煮，使枣中的酚类物质更充分的溶解出来。而苹果发酵酒和柿子发酵酒的总酚含量在四种水果发酵酒中含量较低，而二者中苹果发酵酒的总酚含量(443.13 GAE mg/L)略大于柿子发酵酒(422.93 GAE mg/L)，但参照王晓宇 [30] 对葡萄酒的抗氧化研究结果，苹果发酵酒和柿子发酵酒的总酚含量仍约为白葡萄酒的1.4倍。综上，四种水果发酵酒均具有较高的营养和保健功能。
Figure 4. Comparison of total phenolic content of four fruit fermented wines
图4. 四种水果发酵酒的总酚含量对比
2、水果发酵酒中总黄酮含量分析在紫外可见分光光度计510 nm波长下测定不同浓度梯度的芦丁吸光度值，绘制标准曲线如图5所示。得到标准线性回归方程：A = 11.193T + 0.0038，其中R2 = 0.9995，A：不同浓度芦丁的吸光度值(Abs)；T：芦丁的质量浓度(mg/mL)。
以芦丁浓度来表示酒样中的总黄酮含量。四种果酒的总黄酮含量如图6所示。总黄酮也属于果酒中起抗氧化作用的主要功能性成分，试验测定了不同果酒总黄酮含量，结果表明总黄酮含量：葡萄发酵酒为419.27 mg/L，苹果发酵酒为161.92 mg/L，柿子发酵酒为157.64 mg/L，枣发酵酒为118.91 mg/L，相互间差异显著。综合来看，葡萄发酵酒中所含的总黄酮含量比其他三种发酵酒的含量更高。
Figure 6. Comparison of total flavonoids in four fruit fermented wines
图6. 四种水果发酵酒总类黄酮含量对比
3、cAMP测定分析绘制cAMP标准曲线如图7所示。得到标准线性回归方程：y = 11907x + 89.275，其中R2 = 0.9992，y：不同浓度cAMP的峰面积；x：cAMP的浓度(mg/mL)。
将四种酒样原液经0.45 µm滤膜过滤后通过高效液相色谱仪进行cAMP测定，测定出样品的峰面积，通过cAMP标准曲线计算得出四种水果发酵酒的cAMP的含量。
通过对四种水果发酵酒进行cAMP的检测，从图8可知，枣发酵酒中的cAMP含量显著高于其它果酒，为0.147 mg/mL，其次为葡萄发酵酒，含量为0.019 mg/mL，而柿子发酵酒和苹果发酵酒的cAMP含量很少，分别为0.0017 mg/mL和0.0016 mg/mL。由此可知，cAMP在枣发酵酒中含量很高，是枣酒所具有的一种优势，能够吸引消费者，可作为枣发酵酒的一种特色来扩大枣酒的市场。
3.5. 感官评价
四种水果发酵酒的感官评价如表4所示。由表4可知，各类水果发酵酒的感官得分均在70分以上。其中，柿子发酵酒相对来说评分较高，质量为“很好”，原因可能是柿子果酒酒精度相对较低，酸甜可口，并带有花香和果香。但是由于陈酿时间不够或者未加果胶酶等原因，柿子酒的透明程度相对较低，
Figure 8. Contents of cAMP in four kinds of fruit fermented wine
图8. 四种水果发酵酒中cAMP的含量
出现轻微浑浊的现象；葡萄发酵酒和苹果发酵酒分数在80~85之间，质量为“很好”；枣发酵酒的质量为“好”，枣酒的得分偏低，可能是枣酒呈一定的苦味，影响感官评价的结果。从各类水果发酵酒的感官描述综合来看，四种酒样各自具有自身的色泽和香味，口感圆润，酒体平衡，典型明确，风格良好。
Table 4. Results of sensory evaluation of fruit fermented wine
表4. 水果发酵酒感官评定结果
注：1.同列小写字母不同表示差异显著(P < 0.05)。2.完美，85~100；很好，80~85；好，70~80；一般，50~70；不好，<50。
4. 结论
采用GC-MS初步确定了各类水果发酵酒的香气成分。四种水果发酵酒共检测出66种香气成分，均以酯类和醇类为主，酯类含量最高，是构成果酒香气主要成分，四种水果发酵酒的香气成分差异较大。四种水果发酵酒整体果香浓郁，典型性明确，味感醇厚，酒体协调，具有水果发酵酒所特有的风格，葡萄发酵酒含有乳酸乙酯、丁二酸二乙酯等、枣发酵酒含有庚酸乙酯、肉豆蔻稀酸乙酯等、苹果发酵酒含有三甲基十二碳四烯、金合欢烯等、柿子酒含有二羟基丙酮、乙基己基乙酸酯等，其中柿子发酵酒具有更加协调丰富的香气组成。
通过对四种发酵型果酒的抗氧化活性进行分析比较发现，葡萄发酵酒，枣发酵酒抗氧化活性相对较高。葡萄酒的总酚、总黄酮含量也显著高于其它三种酒。果酒较好的抗氧化性能使其在保藏过程具有更好的稳定性和更长的贮藏时间。这也说明了当前市面上为什么葡萄酒的消费量更大，更能得到消费者认可的原因。
基金项目
河北农业大学大学生创新创业训练计划资助项目(202110086018)、河北省重点研发计划项目(19227141D)。