基于近红外光谱结合化学计量学的银杏酮酯喷干粉中的总黄酮醇苷的检测研究

Research on the Determination of Total Flavonol Glycosides in Ginkgo Ester Spray Powder Based on Near Infrared Spectroscopy and Chemometrics

摘要: 目的：本研究旨在建立近红外光谱法快速检测银杏酮酯喷干粉中总黄酮醇苷的方法。方法：利用化学计量学中PCA方法，结合霍特林T检验算法判定采集到样品的近红外光谱是有效的，使用偏最小二乘法(partial least squares, PLS)建立银杏酮脂喷干粉中总黄酮醇苷的快速检测方法。结果：根据Hotelling’s T²判定结果，采集的63批样品光谱数据无异常值，符合后续建模要求。使用模型评价方法对模型的稳定性、拟合程度、准确性进行考察，符合模型建立要求。结论：上述方法可用于银杏酮酯喷干粉的总黄酮醇苷的快速检测。

Abstract: Objective: The aim of this study was to establish a method for rapid determination of total flavonoid glycosides in ginkgo ester spray powder by near infrared spectroscopy. Methods: The PCA method in chemometrics combined with the Hotelling T test algorithm was used to determine the validity of the near infrared spectrum of samples collected. Partial least squares (PLS) was used to establish a rapid detection method for total flavonol glycosides in ginkgo ester spray powder. Results: According to Hotelling’s T² judgment results, the collected spectral data of 63 batches of samples had no normal values, which met the requirements of subsequent modeling. The stability, fitting degree and accuracy of the model were investigated by using the model evaluation method, which met the requirements of model establishment. Conclusion: The method can be used for the rapid determination of total flavonol glycosides in ginkgo ester spray powder.

1. 引言

银杏归属于银杏科、银杏属，为中生代孑遗的稀有物种，目前为我国特产，有“活化石”之称。作为中药，常以其叶和种子入药。2020年版《中国药典》描述，银杏叶味甘、苦、涩、平，归心、肺经，有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂之功效，临床主用于对瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫和肺虚咳喘等疾病的治疗[1]。银杏酮酯是将银杏叶经过“双重吸附、双重去除”等工艺提取是我国自主开发研制的第五代新型银杏叶提取物[2]。

查阅文献可知现在银杏酮酯含有73个已知化学成分，约占银杏酮酯的75.6%，共可分为四类：银杏总黄酮(黄酮醇苷及其苷元、黄酮苷及其苷元、异黄酮和双黄酮)、萜类内酯(银杏内酯A、B、C和白果内酯)、黄烷醇和有机酸[3] [4]。这些化学成分相互协同作用，是银杏酮酯的药理药效作用基础。银杏总黄酮化合物具有广泛的药理活性，其中最为显著的是其抗氧化性。其主要包括的槲皮素、杨梅素、山柰酚和异鼠黄素等成分，是多酚中的主要抗氧化剂。从而发挥抗炎作用。银杏资源丰富，分布广泛，为我国特有，其显著的药理活性可用于治疗血管相关性疾病。从银杏叶中提取得到的银杏酮酯是我国自主研发药品，经临床实践，证明其单用或联合用药对多种血管相关性疾病具有较好的临床疗效。随着化学成分及其结构的进一步明确，可充分利用现有的网络药理学、现代分子生物学等技术手段，深入开展并明确银杏酮酯多靶点、多系统、多环节的作用机制，为银杏酮酯在血管相关性疾病治疗中的安全合理应用提供科学依据[5] [6]。

目前，药品质量控制仅依赖于对成品的检验，往往忽视了生产过程中有效成分的变化情况，但传统检测技术一般需要复杂的样品处理，并且耗时较长[7] [8]，近红外光谱分析(Near-Infrared Spectroscopy, NIRS)技术作为检测技术中的一朵奇葩，具有无需样品预处理、无损耗、检测速度快等特点，已作为一种成熟的快速分析技术广泛应用于食品、材料等领域[9]-[12]。

2005版《中国药典》中指出“近红外分光光度计法”的指导原则列入附录，近红外光谱技术在制药行业的应用日益广泛。可用于药品原材料的快速鉴别与质量检测，确保成分的纯度和一致性[13]。在生产过程中，能实时监控反应进程和产品质量，可实现无损的定性定量分析。此外，还能辅助药品研发，优化配方。总之，近红外技术提升了制药的效率和质量控制水平，促进了制药行业的发展。

化学计量学在制药行业应用广泛，能精准分析药物成分，可优化制药工艺，实现质量控制的实时监测，还能帮助优化药物配方，降低成本，提高制药的效率和安全性，为制药行业的发展提供有力支持。本研究将近红外光谱法与化学计量学相结合，通过利用主成分分析方法将多维数据进行投影降维，使用霍特林T检验算法确定生产过程中采集到的近红外光谱是否为有效数据，使用定性判别法建立银杏酮酯喷干粉中总黄酮醇苷的快速检测模型，以期实现生产过程质量控制中无损含量测定。

2. 实验部分

2.1. 仪器与试剂

银杏酮酯喷干粉药材(上海上药杏灵科技药业股份有限公司)；仪器信息见表1，试剂材料见表2。

Table 1. Experimental instruments and manufacturers

表1. 实验使用仪器及厂家

设备	厂家
MPA Ⅱ近红外光谱仪	德国布鲁克公司
BS124S型电子天平	北京赛多利斯系统有限公司
Angilent 1260高效液相色谱仪	安捷伦科技有限公司

Table 2. Reagents used in the experiment and their manufacturers

表2. 实验使用试剂及其厂家

试剂	厂家	纯度
甲醇	默克股份两合公司	GR
磷酸	国药集团化学试剂有限公司	AR
槲皮素	中国食品药品检定研究院	≥98.5%
山柰酚	中国食品药品检定研究院	99.1%
异鼠李素	中国食品药品检定研究院	99.1%
甲醇	国药集团化学试剂有限公司	AR
浓盐酸	国药集团化学试剂有限公司	AR

2.2. 近红外漫反射光谱采集

银杏酮酯光谱采集预处理：生产稳定时，每隔半小时取样一次，共取样63个。

光谱采集条件：采集在线生产过程中的银杏酮酯喷干粉样品，使用MPAⅡ近红外光谱仪采集漫反射光谱，范围4000~12,000 nm，分辨率16 cm⁻¹，扫描速度：7.5 kHz，如图1。

Figure 1. Near infrared spectrum of ginkgo ester spray powder

图1. 银杏酮酯喷干粉近红外光谱

2.3. 银杏酮酯喷干粉总黄酮醇苷的测定

银杏酮酯喷干粉中总黄酮醇苷检测条件见表3。根据药典条件要求完成仪器系统适应性试验[1]。

Table 3. Chromatographic conditions for detection of total flavonoid glycosides

表3. 总黄酮醇苷色谱检测条件

色谱柱	ZORBAX SB-C18 (4.6 × 250 nm, 5 μm)
柱温	40℃
流动相	甲醇-0.5%磷酸溶液(49:51)
流速	1 mL/min
波长	368 nm
洗脱时间	25 min

参照高效液相色谱法(通则0512)测定总黄酮醇苷含量方法，取三种标准品，使用甲醇溶解并稀释得到对照品溶液。并取样品75 mg，用甲醇-25%盐酸溶液25 ml，水浴85~90℃中加热回流，冷却至室温，甲醇定容[14]。

2.4. 数据处理

由于生产过程中存在因人为情况采集光谱异常，导致后端总黄酮醇苷模型整体建立的偏移，导致生产放行出现异常。因此，根据2.2项下样品收集结果扫描光谱，通过光谱导入Unscrambler X软件中，选择光谱预处理方法将采集到的光谱中由于背景、噪声、环境导致的差异进行剔除。利用主成分分析方法对光谱数据进行降维，得到光谱数据得分值，使用得分值计算整体Hotelling’s T²的控制线，且要求所有光谱点的Hotelling’s T²值位于控制线以内，则表示光谱数据无异常，且可用于后续建模。

2.5. 模型性能评价

根据前期筛选合格的光谱数据，对应测定的银杏酮酯总黄酮醇苷的理化值数据。将数据导入OPUS数据分析软件中，建立PLS模型，对模型进行评价。要求决定系数R²接近1，RSEC和RSEP数值越小且差异小，表明模型的拟合结果较好，预测结果更为精确。RMSEC和RMSEP之间差值越小，则模型稳定性较好。

3. 结果与讨论

3.1. 银杏酮酯喷干粉总黄酮醇苷含量测定结果

按照2.3项下的方法测定63个银杏酮酯喷干粉中总黄酮醇苷含量，含量的范围32.67~38.515%之间。

3.2. 光谱数据处理

根据2.4项数据处理方法，使用矢量归一化(SNV)预处理对光谱进行降噪处理，将处理后的光谱数据使用PCA降维，选择三个主成分(≥80%)得分值，计算得到63个样品的Hotelling’s T²值，及整体采集的控制线如图2所示。

Figure 2. Hotelling’s T² control chart

图2. Hotelling’s T²控制图

将通过前期Hotelling’s T²判定的光谱对应测定理化值数据相对应，使用PLS法建立银杏酮酯总黄酮醇苷的含量模型，得到模型如图3所示。

通过比较发现，银杏酮酯喷干粉总黄酮醇苷含量模型通过进行光谱预处理后得到的模型SEC为0.217、SEP为0.294，两者之间数值与差值均小，见表4。R²V = 0.9784，R²C = 0.9517，模型稳定性和拟合能力较强，符合模型建立要求。

Figure 3. Schematic diagram of total flavonoid glycosides model of ginkgo ester spray dry powder

图3. 银杏酮酯喷干粉总黄酮醇苷模型示意图

Table 4. Parameters of total flavonol glycosides content model

表4. 总黄酮醇苷含量模型参数

建模方法	PLS-交叉验证–留一法
指标	SEC	SEP	R2V	R2C
总黄酮醇苷	0.217	0.294	0.9784	0.9517

3.3. 准确性考察

Figure 4. Prediction effect of total flavonol glycosides

图4. 总黄酮醇苷预测效果图

为保证模型的稳定性，继续收集银杏酮酯生产喷雾干燥粉样品56个，按照2.3及2.4项下内容对样品进行理化值检验及光谱进行Hotelling’s T²定性判别分析，通过后，得到验证集样本的真实值与预测值对比。根据结果可知，数值接近，符合中药分析要求，如图4。

3.4. 显著性考察

为了确定数据的差异及关系是真实存在而非随机因素导致，因此对数据进行显著性考察。根据显著性分析结果，P > 0.05，真实值与预测值之间无显著性差异，如表5。

Table 5. Paired samples t-test table

表5. 成对双样本均值的t-检验表

t-检验：成对双样本均值分析	变量1	变量2
平均	36.29282	36.28696
方差	0.924937	0.847152
观测值	56	56
泊松相关系数	0.952036
假设平均差	0
df	55
t Stat	0.148924
P (T ≤ t)单尾	0.441079
t 单尾临界	1.673034
P (T ≤ t)双尾	0.882158
t双尾临界	2.004045

3.5. 差值的正态分布

Figure 5. Normal distribution test histogram

图5. 正态分布检验直方图

为验证模型的可靠性，对比真实值与预测值之间的差值分布。结果可知，P > 0.05，表明差值符合正态分布，如图5。

4. 结论

本研究利用化学计量学方法，先对采集到的近红外光谱进行整体判定，保障了光谱的有效性。通过Hotelling’s T²定性判别的63批光谱数据，是属于相同类型且没有异常光谱的情况后，再利用PLS算法建立银杏酮酯喷干粉中总黄酮醇苷的含量模型，并通过模型性能评价(SEC = 0.217, SEP = 0.294, R²V = 0.9784, R²C = 0.9517)表明模型可靠性和稳定性，此模型可用于后续银杏酮酯喷干粉中总黄酮醇苷的含量测定，实现无损、快速检测的效果。